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液相色谱质谱联用技术在体外药物代谢物筛查中的应用李鹰飞，李 迎，张振清（军事医学科学院毒物药物研究所，北京 １００８５０）摘要：高效液相色谱与质谱联用技术已是现代药物发现中药物代谢产物筛查和鉴定最强大的分析手段，可以从品种繁多的样品中得到丰富的信息。本文关注这些技术在体外代谢研究中的应用，尤其是在筛查和鉴定生物转化形成的化学稳定代谢产物或反应性代谢产物方面的应用。为满足指定检测任务需审慎考虑选择合适的检测仪器，在代谢产物筛查中飞行时间质谱和静电场轨道阱质谱检测效率明显高于其他类型质谱。关键词：液相色谱质谱联用；药物代谢；体外代谢产物分析中图分类号：Ｒ９６５．２；Ｒ９１４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４０４４０（２００９）０６０４６１０４ 收稿日期：２００９０９１４ 作者简介：李鹰飞，男，博士后，研究方向：药物非临床药代动力学研究、药物药物相互作用研究、中药药物代谢方法学研究，Ｔｅｌ：０１０６６８７４６１０，Ｅｍａｉｌ：ｌｙｆ３３４＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ通讯作者：张振清，男，研究员，博士生导师，研究方向：化学药及天然药物药代动力学及药物代谢研究，Ｔｅｌ：０１０６６９３０６３２，Ｅｍａｉｌ：ｚｑｚｈａｎｇ５５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ１ 前言药物从体内消除主要是通过酶生物转化反应完成的，这些反应与生物利用度、药代动力学、药效学紧密相关。因此，在药物发现与开发过程中，了解候选分子代谢性质的相关信息非常重要。数十年前，由于技术上的原因使得代谢产物的鉴定非常困难。液相色谱质谱联用（ＬＣＭＳ）技术的发展极大地提高了对类药物质及其代谢产物的检测和鉴定能力，也成为分析药物代谢最合适、最有效的工具。现在，多数类药化合物使用电喷雾离子化（ＥＳＩ）质谱分析，极性小的化合物则采用大气压化学离子化（ＡＰＣＩ）质谱或大气压光离子化（ＡＰＰＩ）质谱进行检测。虽然近年来随着液相色谱和质谱的发展，药物代谢产物检测的分析方法已远远超出本世纪初对检测速度、检测灵敏度及其他性质的要求，但是在很多实验室，液质联用技术常常应用不当。本文关注于如何从分析角度考察在体外系统中药物代谢产物的检测和鉴定的ＬＣＭＳ分析方法。２ 代谢产物筛查和鉴定的分析方法用于早期代谢产物谱筛查的ＬＣＭＳ方法并不需要过多优化，多采用快速通用的色谱方法，如短梯度洗脱，乙腈∶水作为洗脱相。乙腈在几分钟内由５％增加到９０％。如果不需要进行实时高通量筛查，侧重的是数据质量而不是分析速度，可以调节洗脱梯度的强度、水相ｐＨ值，从而提高检测灵敏度、改善峰形，检测到更多的代谢产物。使用细内径、小颗粒的短色谱柱时效性最好。近来，主要色谱柱生产商都引入了粒径小于２μｍ填料的色谱柱及相应的色谱设备，这一技术被称为超高效液相色谱（ＵＰＬＣ）或快速解析液相色谱。较小粒径的色谱柱填料可以提高分离效率、增强检测灵敏度、节约分析时间。２１ 软件辅助代谢物筛查通常通过比较样品和空白对照的色谱数据来筛查代谢产物。比较来自样品和阴性对照样品数据最有效的方法是应用特别开发的代谢产物筛查软件。质谱控制软件都有用于代谢产物筛查的子程序，这些软件具有内建智能，对检测到的代谢产物鉴定（或生物转化）给出可能的推断。此外，对碎片离子数据进行解析的软件也被引入其中。市场上也有基于知识库或代谢规律的商业化软件，如ＭＥＴＥＯＲ。尽管正确使用软件辅助代谢筛查会非常有效（但错误的参数可以导致假阴性的结果），还是常常需要对预期的代谢产物进行手动检索。Ａｎａｒｉ等报道了一种将代谢产物预测和ＬＣＭＳ代谢产物谱结合的技术，即根据商用的数据库中基于已知的代谢途径预测和自动ＬＣＭＳｎ数据采集设备，应用一台离子阱质谱对代谢产物进行预测。此外，Ｚｈａｎｇ等引进了一种软件以加快代谢产物谱扫描，即一种对高分辨ＬＣ／ＭＳ数据进行全面的自动背景扣除算法。该方·１６４·国际药学研究杂志 ２００９年１２月 第３６卷第６期法在空白样品和分析样品存在色谱波动时有用。２２ 生物转化的鉴别应用质谱数据可以确定检测出的代谢产物所经过的代谢反应（生物转化）途径。液相色谱与采用电喷雾离子化的现代大气压离子化模式的质谱偶联时，分子离子数据可以阐明生物转化中相对分子质量的变化。如果质谱的质量精确度足够好，小于５ｐｐｍ（如ｍ／ｚ５００，精确度＜２５ｍｕ），得到精确相对分子质量就可以确定生物转化所引起的分子结构式改变，但是同样的标称质量改变可能是不同的生物转化造成的。比如羟基化同时脱氢生成的代谢产物和甲基化生成的代谢产物是不同的，尽管这２个转化都会增加１４个质量单位（标称质量水平）。飞行时间质谱（ＴＯＦ）、静电场轨道阱质谱和傅立叶转换离子回旋加速共鸣质谱（ＦＴＩＣＲＭＳ）是可进行精确质量测定的典型质谱。通过串联，质谱可以依次产生碎片离子，提供附加信息阐明分子生物转化的位点和代谢“软斑”。通常三重四极杆、离子阱或四极杆飞行时间质谱（ＱＴＯＦ）均可用于串联质谱研究。２３ 高分辨质谱———初始代谢产物筛查工具因为市场上的质谱类型多种多样，不同实验室进行类似研究的可用仪器也各不相同，因此各实验室用于初始代谢产物筛选的方法也迥然有别。不同类型质谱用于代谢产物谱扫描，其适应性大不相同，所以数据质量和结果的可信程度极大依赖于适合该任务质谱类型。２３１ 飞行时间质谱、四极杆飞行时间质谱 ＴＯＦ尤其是ＱＴＯＦ是用于快速、高效进行代谢物谱扫描和代谢物试验性认定最合适的质谱。这２种质谱的优点在于获得宽质量范围数据时仍具有极高的检测灵敏度，一次进样就可检测到所有预期和未预期的代谢产物数据，并且不需要针对特定类型的代谢产物进行预先调节。此外，这２种质谱分辨率好、准确度高（３～５ｐｐｍ），使得生物转化的确认准确、可信。最后，ＴＯＦ分析仪数据采集速度快，使其成为快速色谱的理想工具。近来，多篇论文报道了ＱＴＯＦ结合ＨＰＬＣ或ＵＰＬＣ分离步骤在体外代谢产物谱扫描的应用。以往，这类方法的瓶颈为高容量信息的获得，现在技术已得到发展。Ｔｉｌｌｅｒ等报道了一种半自动的高通量ＬＣ／ＱＴＯＦＭＳ系统，每天可以分析多达２１个新化合物实体。２３２ 静电场轨道阱（Ｏｒｂｉｔｒａｐ） 在市售的高分辨质谱类型中，静电场轨道阱是最近才推向市场的，其应用线性离子阱初步选择待测离子，从而获得高质量分辨率。同样，该类型质谱在宽质量范围筛查时灵敏度高，也可以串联质谱以获得母离子和碎片离子的精确质量数。但是，与ＴＯＦ质谱仪相比，静电场轨道阱质谱采集数据速度较慢，因此不适合用于快速色谱分析。２４ 采集后数据挖掘技术质量亏损过滤是一种采集后数据挖掘技术的软件，可以将总离子色谱从那些超出代谢产物预期精确质量亏损的所有数据中过滤出来。近年来，很多研究对这类软件在飞行时间质谱、静电场轨道阱质谱、离子回旋响应傅立叶转换质谱的代谢物谱扫描方面的应用进行了报道。２５ 精确质量相同的代谢产物一些生物转化具有相同元素组成，并不能仅凭精确质量将其区分，在某些情况下，对于一个观察到的生物转化即使准确质量数据相同，也可能结构不同。例如，与母体化合物相比，羟基化、Ｎ或Ｓ氧化或环氧化反应都有相同的质量漂移（＋１５９９４９ｕ）。如何区别根据精确质量数据得到的可能生物转化？一个有效的方法是氢氘交换液相质谱，或者使用氘化的流动相，或者在进行液相质谱分析时柱后输注氧化氘。羟基、氨基、巯基或羧基上不稳定的、易交换的质子与同位素氘交换，与非氘溶剂液相质谱数据相比较，其在ｍ／ｚ上的增加可以说明代谢物结构中不稳定质子数，从而区分是哪一种同位素生物转化。作为Ｈ／Ｄ交换的替代方法，一些论文建议以Ｎ氧化产物而不是羟基化代谢产物形成的［Ｍ＋Ｈ－Ｏ］＋作为区分这２类代谢产物的标志物。２６ 其他质谱类型的适应性上文提到的用于代谢物谱扫描的各类型质谱在大的制药公司得到广泛应用，这些公司可以合理分配财力资源以保证每个分析都采用正确的质谱类型。大公司对仪器的优化使用省时省钱，也获得最高质量的数据。而一些小公司和实验室由于其在分析仪器上经费预算的限制，在代谢物筛查的研究中只能使用其他类型的质谱，其中最典型的就是三重四极杆，这样就降低了数据的质量、耗费更多的时间、增加假阴性结果的几率。但是，这些仪器类型也有其优点，广泛应用于很多药物研究初始阶段。上文提到的质谱类型最适合初始药物研究阶段代谢产物的筛查，但在不具有相应仪器的情况下，尽管与·２６４·ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ ２００９Ｄｅｃ；３６（６）ＴＯＦ或静电场轨道阱质谱相比，下文所描述的质谱类型，如三重四极杆、离子阱、杂合四极杆线性离子阱（ＱＴｒａｐ）用起来更麻烦、费劲，但通常还是会得到期望的信息，也远远优于其他任何类型的非质谱分析方法。２６１ 离子阱质谱 离子阱质谱分辨率不高，宽质量范围筛查灵敏度相对较高，采集数据相对较慢，质量精确度也不如ＴＯＦ或静电场轨道阱质谱。离子阱质谱也可以进行质谱串联，尽管与三重四极杆或ＱＴＯＦ质谱相比结构信息量较少，但也可以提供关于生物转化部位的结构数据。应用传统的３Ｄ离子阱质谱对多种药物肝微粒体孵育的代谢产物谱扫描多有报道。近来，具有不同类型捕获阱结构的线性离子阱的新发展已使其超越了传统３Ｄ阱的表现。２６２ 三重四极杆质谱 三重四极杆质谱是分析实验室中最普通的质谱仪，对已知分析物的定量分析具有很高的灵敏度，也具有极好的质谱串联特性。但三重四极杆质谱仅在使用多反应监测（ＭＲＭ）模式时检测灵敏度高，当进行宽质量范围分析时，检测灵敏度显著下降，这是其筛查未知代谢产物的一个主要不足。２６３ 三重四极杆线性离子阱质谱（ＱＴｒａｐ） 该方法中，最后一个四极杆被一个线性离子阱代替，与传统的离子阱或三重四极杆质谱相比，其代谢产物筛查能力大为提高。该质谱仪整合了离子阱质谱的多级质谱打碎能力、宽范围扫描的高灵敏度以及三重四极杆质谱的碎片离子数据质量高、ＭＲＭ模式数据采集灵敏度高的优点。２７ 特定结构数据采集模式为了避免采集后对数据挖掘，增加分析的特异性，大多数的质谱仪可用于检测具有确定结构特征化合物的特定信息。诸如中性丢失（ＮＬ）扫描或先驱离子扫描（ＰＩＳ）等不同的特定结构数据采集模式被用于代谢产物筛查，尤其用于三重四极杆质谱的代谢产物筛查。由于这些用于四极杆质谱分析仪的检测模式检测灵敏度不如ＴＯＦ或离子阱质谱分析仪，使得该类检测模式的效率受到限制。该类模式只限于检测那些与母体化合物具有类似碎片的代谢产物，这也意味着其可能错过未预期的代谢产物。２８ 数据依赖性数据采集技术对于一些质谱类型，数据（或信息）依赖性数据采集技术也是一个相对常见的方法。一旦检测到那些超过某一强度阈的离子或某一特定ｍ／ｚ的离子就自动触发不同的数据采集模式。数据依赖性数据采集模式明显增加单次液质分析所得到的信息量。此外，该模式也不仅局限于三重四极杆或离子阱质谱，其他的质谱也可采用他，尤其是ＱＴｒａｐ质谱。近来也有文章对该技术结合三重四极杆技术应用于药物代谢进行综述。２９ 代谢稳定性———分别分析还是同时分析？通常代谢稳定性通过人体外孵育系统比如肝切片、微粒体、肝细胞测定，该结果可以用来推测体内的情况。代谢稳定性检测方法较直接、分析简单，多应用快速通用梯度洗脱，仅需要几分钟时间。近来一些公司开始使用三重四极杆、离子阱、四极杆线性离子阱和ＴＯＦ，在单次ＬＣＭＳ分析中，对母体化合物代谢稳定性进行定量，同时筛查预期和非预期的代谢产物。这种做法节约时间、节省仪器资源、减少研究所需要的生物材料。２１０ 反应性代谢产物众所周知，药物的反应性代谢产物是造成药物非预期毒性的因素之一，因此需要尽可能早的在药物开发阶段花大力气对其进行鉴定。反应性代谢产物通常是亲电化合物，可与诸如谷胱甘肽之类的亲核物质反应。传统方法是筛查谷胱甘肽结合物，应用液相色谱串联质谱的电喷雾正离子模式，通过中性离子丢失扫描１２９ｕ来监测。该方法的缺点是检测灵敏度不高，需要结合物的浓度很高，水溶性不好的结合物的检测尤其成问题。此外，有些类型的