肿瘤的分子生物学检验技术

第十五章线粒体病的分子生物学检验技术滨医附院检验科袁笑“千手观音”21位聋哑演员中18人有药物史部分患者使用正常剂量也会致聋“一针致聋”现象线粒体基因突变（A1555G）+环境（使用氨基糖苷类）线粒体（Mitochondrion）31.真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2.多数细胞含几个到几千个线粒体3.每个线粒体含2-10线粒体DNA（mtDNA）线粒体的主要功能1、参与人体很多重要的生物化学过程（三羧酸循环、脂肪酸β氧化、氨基酸分解代谢、血红素合成和部分尿素合成过程）被称为“细胞的能量工厂”2、线粒体体积大小，数量增减反应器官功能负荷的变化。第一节线粒体基因组及其表达系统第一节线粒体基因组与线粒体病人体细胞中的线粒体DNA具有自主的DNA复制、转录功能，为非孟德尔遗传方式，故称为25号染色体。25号染色体7（一）人类线粒体基因组1、基因组小,16569bp2、双链环状DNA外环富含鸟嘌呤称为重链，内环富含胞嘧啶称轻链3、1）编码区13结构基因/mRNA22tRNA基因2rRNA基因2）非编码区D-loop（约1120bp）L链复制起始区（约30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）一、线粒体基因组及其表达系统1、结构基因7个为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体Ⅰ）的亚基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6）1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体Ⅲ）中细胞色素b的亚基3个为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合体（复合体Ⅳ）催化活性中心的亚单位（COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ）2个为ATP合酶复合体（复合体Ⅴ）F0部分的2个亚基（A6和A8）1、结构基因2、tRNA基因22个tRNA基因可转录20种tRNA满足线粒体内蛋白质翻译的需要。tRNALeutRNASer都有2个基因外，其余18种均只有1个基因。3、rRNA基因1、mtRNA编码两种rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H链tRNAPhetRNALeu之间以tRNAVal相隔3、变异常发生在二级结构茎环上。4、非编码区D-loop（约1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，约1120bp,是mtDNA中变异最多的区域，参与并调控mtDNA的复制和转录。L链复制起始区（约30～50bp，tRNAAsn-tRNACys可折叠成茎环结构。（二）线粒体基因表达系统及特点1、密码子1979年，Barrell报道了人线粒体DNA所用的遗传密码。通用遗传密码和线粒体遗传密码的差异密码子线粒体DNA编码核DNA编码UGA色氨酸终止AUA起始异亮氨酸AGG终止精氨酸（二）线粒体基因表达系统及特点2、mtDNA复制特点D环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制，轻链以顺时针方向复制。nDNA只在细胞分裂时复制，mtDNA一直处于分裂状态，并由nDNA编码的调控因子控制。mtDNA复制特点mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。（二）线粒体基因表达系统及特点3、mtDNA转录的特点对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。成熟的mRNA只在3ˊ末端加polyA尾巴，5ˊ末端不修饰帽子结构（二）线粒体基因表达系统及特点4、线粒体蛋白质的合成特点自主编码合成13个多肽，其余功能所需蛋白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系十分相似。“共生学说”18核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制（三）mtDNA与nDNA的相互关系1、nDNA的表达状况可直接影响和调控mtDNA的表达和线粒体蛋白质的生物合成。2、mtDNA突变可直接影响mtDNA所编码蛋白多肽的合成，而影响有氧呼吸、物质代谢和能量代谢，并进一步通过线粒体功能变化反馈影响nDNA的复制和表达。3、各种转录因子是其通讯的基础。“交叉对话（cross-talk）”机制二、线粒体病的概念因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。主要累及大脑和肌肉组织。分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病线粒体功能涉及众多的组织器官21三、线粒体病的特征（一）母系遗传与遗传早发线粒体疾病的母系遗传(二)同质性突变与异质性突变与发病阈值效应24线粒体基因同质性（Homoplasmy）0或100%异质性（Heteroplasmy）0-100%核基因纯合子（Homozygous）0或100%杂合子（Heterozygous）50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值25线粒体DNA的突变率极高，约比核DNA高10-20倍。线粒体DNA排列紧凑，没有内含子，任何mtDNA的突变都可能影响其基因组的重要功能；线粒体DNA缺少组蛋白的保护；线粒体DNA容易被呼吸链生成自由基氧化损伤；线粒体中没有DNA损伤的修复系统；四、线粒体病的分子生物学检验标志四、线粒体病的分子生物学检验标志（一）mtDNA碱基位点1、点突变1）结构基因点突变包括同义突变和错义突变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋白质结构和功能的改变，导致疾病。Leber视神经病（LHON）：G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）1、点突变2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋白质的生物合成的能力，从而影响线粒体氧化磷酸化的功能，导致疾病的发生。MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G(80%),T3271C（在tRNALeu(UUR)基因）四、线粒体病的分子生物学检验标志2、单核苷酸多态性位点单个核苷酸变异引起的mtDNA序列的多态性，与不同人群有关。3、线粒体单体群在进化过程中，母系遗传的mtDNA为适应环境所形成的碱基位点多态性集合。（二）mtDNA缺失或插入片段大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。常见缺失：8483～13459：Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病；8637～16073：与衰老有关的退行性疾病；4389～14812：能量代谢受到严重破坏。（二）mtDNA拷贝数的变化mtDNA拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞中mtDNA拷贝数下降，有可能成为一种新的肿瘤标志物。第二节线粒体病分子生物学检验技术及质量控制一、线粒体病分子生物学检验策略二、线粒体病的分子生物学检验技术（一）PCR-RFLP技术PCR-RELP的质量控制（1）模板DNAD的制备和引物设计：设计合适的引物扩增目的模板DNA（2）酶的选择：去除干扰物质，根据酶活性要求选择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积的10%。（3）PCR扩增体系和酶切反应条件：优化保证PCR产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切酶活性，适时终止反应。（4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增基因的变异情况。二、线粒体病的分子生物学检验技术（二）变性高效液相色谱法在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。DHPLC检测的质量控制1、DHPLC检测的样本要求（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。（2）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物需优化PCR去除。（3）样品含量：PCR浓度必须足够大，要求2微升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于浓度至少20ng/ul.（1）PCR引物的设计：引物长度200-500bp范围，且只有一个溶解区域，无错配的PCR片段（2）PCR反应条件的优化，控制好温度和时间达到模板双链完全变性、复性（3）DHPLC检测上样前要验证PCR产物质量，以保证结果准确性。（4）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰，表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买阳性质控品。2、DHPLC检测的条件优化二、线粒体病的分子生物学检验技术（三）DNA芯片技术略（四）DNA测序技术略三、线粒体病的分子生物学检验应用（一）MELAS综合征11月23日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。可晓炎吃过饭后不久，就开始呕吐。当晚凌晨2点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打120，急救车将女儿送到医院救治。入院后的晓炎，直接被送进了ICU重症监护室。经过医院的多次检查，也没有最终确诊，院方建议顾春娜带晓炎去北京治疗。到了北京儿童医院，终于确诊晓炎患上的是一种因遗传基因的缺陷而导致的线粒体结构和功能的异常，病症名称为线粒体脑肌病。MELAS综合征发病特点母系遗传10～40岁发病，10岁前发育正常。首发症状为运动不耐受、卒中样发作、偏轻瘫、失语、皮层盲或聋。并有肢体无力、抽搐或阵发性头痛、智能低下——痴呆及乳酸血症MELAS基因已发现4种点突变与大多数MELAS病例有关，其中2种分别在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常见其中80%是A3243G的突变45399bp307bp92bpMUn-cut143B43B12A3243G为异质性突变PCR-RFLP（限制酶ApaⅠ）PCR-DHPLCWTA3242Gmt3243突变DNA序列测定3243正常序列突变杂合子三、线粒体病的分子生物学检验应用（二）Leber遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病是以德国眼科医生TheodorLeber的名字命名的，又称Leber视神经萎缩，为一种急性或亚急性发作的母系遗传病，男女病人比例5:1，至今尚未发现一个男性患者将此病传给后代。视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急性亚急性视力减退，中心视野丧失明显，导致失明。突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性Saillardetal.(2000)T3394CND1同质性Hofmannetal.(1997)G3460A*ND1同质性/异质性Huoponenetal.(1991)C3497TND1同质性Kongetal.(2003）G3733AND1同质性/异质性Valentinoetal.(2004)C4171AND1同质性/异质性Kimetal.(2002)T4216CND1同质性Torronietal.(1994）A4435GtRNAMet同质性Herrnstadtetal.（2002）G7444ACOⅠ同质性Huoponenetal.（1993）T10663CND同质性Brownetal.(1995)G11696AND4同质性/异质性Zhouetal.（2006）G11778A*ND4同质性/异质性Wallaceetal.(1988)T12338CND4同质性Wongetal.（2002）G14459AND6同质性/异质性Junetal.(1994)C14482G/AND6同质性/异质性Howelletal.(1998)T14484C*ND6同质性/异质性Johnsetal.(1992)A14495GND6异质性Chinner