滋补肝肾中药对局灶性脑缺血大鼠脑内基质金属蛋白酶表达的影响

付强，郭春莉，王新陆山东中医药大学临床学院，山东济南(250014)E-mail：[e-mail]摘要：目的：脑梗死后星形胶质细胞的过度活化将形成胶质瘢痕阻碍轴突生长，基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）是分解细胞外基质的蛋白酶类中最重要的一类。本实验拟研究滋补肝肾中药复健片对局灶性脑缺血大鼠脑内MMP－2、MMP－9表达的影响，探讨复健片治疗缺血性卒中的作用机理。方法：雄性Wistar大鼠49只随机分为假手术组、模型组（分设1w、2w、3w组）、给药组（分设1w、2w、3w组），模型组与给药组进行右侧近端大脑中动脉电凝术造成大鼠局灶性脑缺血模型，假手术组行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型组。于造模成功后第6天起药物组灌胃给予复健片，剂量为9g生药/kg/d，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次。分别在相应时间点取材后用酶联免疫吸附法检测MCAO大鼠脑内MMP－2、MMP－9的表达。结果：假手术组MMP－2、MMP－9（µg•ml-1）为334.17±6.68，536.17±8.31；模型组给药1w后为582.00±6.21，800.40±7.02；给药2w后为573.80±6.30，793.80±6.54；给药3w后为565.00±9.10，787.33±6.77；药物组给药1w后为590.80±9.60，806.40±5.77；给药2w后为602.20±3.83，819.40±7.50；给药3w后为613.20±7.23，834.40±8.99。显示模型组MMP-2、MMP-9活性在给药1周后较假手术组有显著差异，说明造模成功；模型组在给药1周、2周和3周后无差异；药物组在治疗2周和3周后同组间较前期有差异，说明MMP-2、MMP-9活性随着用药时间的延长逐渐表达增强；药物组在治疗1周后MMP-2、MMP-9活性较同期模型组尚无显著差异，但2周及3周后表达显著增强，与同期的模型组产生了显著差异。结论：复健片治疗缺血性卒中的作用机理可能与后期上调MMP－2、MMP－9的表达，从而抑制胶质瘢痕的形成，以解除神经功能重塑的负面因素有关。关键词：复健片；缺血性卒中；MMP－2及MMP－91.引言中枢神经系统内的胶质细胞和神经元共同形成一个统一的有机体，胶质细胞参与神经元功能的调节，并在联系和维持神经元生存的微环境中起重要作用。而星形胶质细胞(Astroglia,As)是中枢神经系统最主要的大胶质细胞。脑缺血缺氧后，星形胶质细胞的反应性活化，对神经元具有“双刃”作用[1]。瘢痕阻碍轴突生长的成分主要是胶原，而明胶酶是唯一能降解Ⅳ型胶原三螺旋部位的酶类。Ⅳ型胶原酶主要包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)，通常情况下只以酶原的形式存在，机体主要通过对其基因表达、酶原激活、活性抑制等步骤的调控来控制其降解作用。因此，研究药物对MMP－2及MMP－9的调控作用，可以减少损伤诱导的基膜沉积，从而有利于神经纤维延长穿过损伤区，沿着原先的路径重新支配靶目标，重新髓鞘化，恢复正常传导，使星形胶质细胞的功能扬长避短，对防治神经系统疾病具有重要的意义。2.材料和方法2.1实验设计：随机对照的动物实验研究。2.2单位：实验在山东大学医学院药理实验室、山东中医药大学附属医院完成。1本课题得到高等学校教育部博士学科点专项科研基金（编号20040441018）的资助。材料：实验动物：取雄性Wistar大鼠（清洁级），体重约250－300g，共49只（山东大学实验动物中心提供，动物合格证号：鲁动质字20030004）。单笼饲养一周，自由饮水和摄食。饲养室温度24－25℃，相对湿度7%左右，光照明暗比为13:11。2.4实验仪器造模所需仪器：显微手术钻，XSZ-2型，上海光电公司；双极电凝器，SJ-2型，上海光电公司；WT11001R型电子天平，江苏省常州市万得天平仪器厂；电热恒温水槽，DK-600型，上海精宏实验设备有限公司；手术显微镜，光学显微镜均为上海医用光学仪器厂产品；大鼠固定器。指标检测所需仪器：GZY-DH型电热恒温干燥箱，宁波医疗器械二厂；SEAC型全自动酶标仪，意大利进口；电热恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；高速离心机，德国进口；手工匀浆器；20µL、100µL、1000µL移液器及吸头。2.5实验药品及试剂：复健片（由山东鲁信药业有限公司生产，批号：20030115，主要药物为何首乌、桑寄生、草决明、海马、淫羊藿）；戊巴比妥钠购自上海化学试剂采购供应站分装厂；注射用青霉素钠购自山东鲁抗医药股份有限公司；氯代三苯基四氮唑（红四氮唑，TTC）购自上海试剂三厂；MMP-2、MMP-9酶联免疫试剂盒购自美国BionewtransPharmaciuticalBiotechnologyCo.,Ltd公司，批号：36331。2.6实验方法2.6.1动物分组及造模：大鼠按统计学随机数字表法随机分为假手术组、模型组（分设1w、2w、3w组）、给药组（分设1w、2w、3w组），每组各7只，共49只。模型组和给药组按Tamura[2]的方法稍加改进进行右侧近端大脑中动脉电凝术制备大鼠局灶性脑缺血（MCAO）模型。麻醉醒后24h内出现①左侧肢体痛刺激收缩现象消失；②向左侧倾倒或转圈；③提尾时左上肢不能向前伸直。具备以上3项为大鼠局灶性脑缺血模型复制成功，纳入实验，进行分组，余者弃之。假手术组大鼠行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型组。因手术死亡5只。2.6.2给药及取材：在造模的基础上给予复健片灌胃，给药组分别于造模成功后第6天起开始给予复健片灌胃，剂量为9g生药/kg/d，假手术组与模型组分别给予等量的生理盐水。注：大鼠在进行右侧近端大脑中动脉电凝术后，因伤口疼痛、舌肌瘫痪等原因严重影响动物主动进食，为了保证其营养供应，特在每日早晨和晚间分别灌胃给予5ml牛奶，并将普通大鼠饲料进行软化，制作成球状投放入鼠笼中便于其摄取。分别于给药1w、2w、3w时断头处死大鼠，并取梗死灶周围脑组织置于-80℃冰箱保存备用待测。2.6.3指标检测标本融化后仍然保持2-8℃的温度。与匀浆缓冲液（0.01MPBSPH7.4）以19∶的比例置于玻璃匀浆缓冲器中充分研磨混匀，制成体积分数为10%的脑匀浆。匀浆液置于试管中，离心20分钟左右（2000转/分），仔细收集上清。取出一定量的上清用PBS缓冲液稀释10万倍。采用酶联免疫吸附法测定分析MMP-2、MMP-9的活性。（1）取出酶标板，依照次序对应分别加入50µl的标准品于空白微孔中；（2）分别标记样品编号，加入50µl样品于空白微孔中；（3）在标准品孔和样品孔中加入50µl的生物素标记溶液；（4）37℃孵育反应60分钟；（5）洗板机清洗5次，每次静置10－20秒；（6）在标准品孔和样品孔中加入50µl的酶标记溶液；（7）37℃孵育反应30分钟；（8）洗板机清洗5次，每次静置10－20秒；（9）每孔加入底物A、B液各50µl；（10）37℃下避光孵育反应15分钟；（11）每孔加入50µl终止液，终止反应。2.6.4结果判断及统计学分析（1）仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；（2）以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；（3）根据样品的OD值查找对应的浓度范围；（4）敏感度：0.1ng/ml。所有数据均以均数±标准差（—X±S）表示，采用SAS8.1统计软件包对数据进行处理，多组计量资料的样本均数比较采用方差分析，以α＝0.05和α＝0.01作为检验标准。3.实验结果3.1实验动物数量分析：最初纳入动物49只，造模不成功或死亡14只，最后每组5只共35只大鼠进入结果分析。3.2复健片对局灶性脑缺血大鼠脑内基质金属蛋白酶表达的影响见下表表1复健片对MCAO大鼠MMP-2、MMP-9活性的影响（—X±S）组别样本量时间MMP-2（µg•ml-1）MMP-9（µg•ml-1）假手术组5给药1w后334.17±6.68536.17±8.315给药1w后582.00±6.21A800.40±7.02A模型组55给药2w后给药3w后573.80±6.30B565.00±9.10B793.80±6.54B787.33±6.77B5给药1w后590.80±9.60D806.40±5.77D药物组55给药2w后给药3w后602.20±3.83CE613.20±7.23CE819.40±7.50CE834.40±8.99CE注：与假手术组比较，AP＜0.01；与同组前期比较，BP＞0.05，CP＜0.05；同期组间比较，DP＞0.05，EP＜0.01。结果显示，模型组MMP-2、MMP-9活性在给药1周后较假手术组有显著差异，说明造模成功；模型组在给药1周、2周和3周后无差异；药物组在治疗1周、2周和3周后同组间较前期有差异，说明MMP-2、MMP-9活性随着用药时间的延长逐渐表达增强；药物组在治疗1周后MMP-2、MMP-9活性较同期模型组尚无显著差异，但2周及3周后表达显著增强，与同期的模型组产生了显著差异。4.讨论星形胶质细胞有利于可塑性修复作用发生，在缺血性脑损伤时其在损害区周围形成一胶质界膜，以减少缺血损伤扩大[3]，在正常组织、损伤区及血管之间起着特殊的运输作用，并分泌多种神经营养因子[4]，以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活[5]，利于损伤的修复；但是另一方面过度的胶质化却可作为机械屏障影响髓鞘和轴索的再生，从而影响周围神经组织的结构修复和功能恢复。因而，星形胶质细胞在脑损伤中具有“双刃剑”作用，其在脑内的适度活化无疑具有重要的意义。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）是分解细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的蛋白酶类中最重要的一类。它们存在于正常人体，参与伤口愈合、妊娠分娩等生理过程，也参与了多种病理过程，包括肿瘤浸润、炎症反应等。近来研究表明，MMPs尤其是明胶酶（MMP-2、MMP-9）与脑血管病、脑肿瘤、脱髓鞘病变等关系密切[6]。瘢痕阻碍轴突生长的成分主要是胶原或基膜，其中Ⅳ型胶原是组成细胞外基质的主要结构蛋白，而Ⅳ型胶原酶／明胶酶是唯一能降解Ⅳ型胶原三螺旋部位的酶类。Ⅳ型胶原酶也被称为明胶酶(gelatinase)，主要包括Mr分别为72×103和92×103的明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)，通常情况下只以酶原的形式存在，机体主要通过对其基因表达、酶原激活、活性抑制等步骤的调控来控制其降解作用。脑缺血后涉及MMP活性表达的调节机制还不清楚。由于MMP基因结构中具有AP1(激活剂蛋白1)的结合位点，故认为某些早期基因如c-fos和c-jun可能参与了MMP表达的调节过程；同时，分裂原激活蛋白激酶信号传导路的激活可能也与此有关[7]。MMPs几乎能够降解细胞外基质的所有成分[8]。有学者[9]研究认为活性MMP-9于血管闭塞后3h即可检测到。另有研究结果显示，脑梗死病人发病2－5天内血浆MMP-9水平明显升高，而发病2周时血浆MMP-9水平降至正常[10]。Romanic等[11]则用含明胶的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺电泳(SDS－PAGE)酶谱法检测大鼠MCAO后6至30天内MMP的脑内表达与活性，发现卒中后6h可检测到MMP-9活性，卒中后12h明显升高，24h表达最多。提示脑梗死早期可以诱导MMP-9的表达，并呈现一定的时间效应。脑缺血诱导MMP-9表达升高的确切机制目前尚不清楚。多数学者认为中性白细胞、内皮细胞是脑梗死后早期表达MMP-9的细胞，受炎性介质的刺激，小胶质细胞也能产生[12]；晚期表达则见于巨噬细胞[11]。学者研