药品微生物限度检查方法介绍

1药品的卫生学检查方法介绍（北京市药品检验所戴红）2无菌室的质量管理药品的微生物限度检查药品的无菌检查3无菌室的要求位置选择面积大小洁净度采光紫外杀菌门人流物流地面墙面4无菌室的管理陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。人员：肥皂洗手，0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，手不能来回出入操作台。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气湿气，用紫外灯杀菌半小时。非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。缓冲间不得放杂物、培养箱等。定期对门、窗、墙面等消毒。定期检查洁净度情况。5洁净度的要求应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。6尘埃粒子洁净级别尘粒数/m3活微生数（个）/m3≥0.5um≥5um100级≤3,500≤0≤51000级≤350,000≤20,00≤100100000级3,500,000≤20,000≤500GB/T16294-1996沉降菌洁净级别个/（∮90mm.0.5h）100级≤110000级≤3100000级≤107菌种保存、复壮及管理保存原则保存方法复壮管理8菌种的保存原则挑选特征典型的纯菌菌落确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存选择最适宜的保存方法进行保存定期对保存的菌种进行检查9菌种保存的常用方法琼脂斜面低温保存法甘油冷冻管保藏法半固体琼脂斜面低温保存法液体石蜡保存法超低温保存法（菌种）砂土10菌种的复壮分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的分离通过宿主复壮淘汰退化理化因素诱变11菌种的管理专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等定期有专人按操作规程进行传代接种菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研究处理。实验菌种不得任意带出使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理12菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]大肠埃希菌(Escherichiacoli))[CMCC(B)44102]枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]13菌液的制备（1）接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中，30～35℃培养18~24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使细菌数约为10~100cfu/ml。14菌液的制备（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养18~24小时，取此培养物1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使细菌数约为50~100cfu/ml。15菌液的制备（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加3~5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-6，使细菌数约为50~100cfu/ml。16药品微生物限度检查方法介绍172005年版微生物限度标准的应用•微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。•药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查均以本标准为依据。•检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。182005年版微生物限度标准的分类1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法的规定。2、口服给药制剂3、局部给药制剂3.1.用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌3.2.眼部给药制剂：3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂3.4、阴道、尿道给药制剂3.5、直肠给药制剂3.6、其它局部给药194、含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂5、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准6、霉变、长螨者以不合格论7、原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行20供试品的抽样及检验取量一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量（以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够各种菌检查用的溶液）。所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。液体制剂检验量为10ml。膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及生化药膜剂检查量为10cm2。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。21供试品的保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。22细菌、霉菌、酵母菌计数23实验前的准备工作将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）量筒等移到无菌室内，每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入，操作编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。24平板菌落计数法供试液制备（10倍递增稀释）注平皿倒培养基摇合（45℃营养琼脂玫瑰红钠琼脂YPD琼脂培养基）倒置培养（30～35℃48小时；25～28℃72小时）菌落点数（30～300个30～100个）菌数报告（10条原则）25供试液的制备（1）乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。水浴加温时，温度不超过45℃，时间不超过30分钟。供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。供试液的体积：最终体积为100ml。26供试液的制备（2）稀释剂：pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液肠溶制剂pH7.6磷酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液非水溶性供试品乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消毒）。十四烷酸异丙酯萃取或过滤27供试液的制备（3）液体供试品取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，摇匀，作为1:10供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入稀释剂至100ml，用匀浆仪（3000-5000r/，2—4min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置45℃±1℃水浴振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后45℃±1℃水浴振摇。28供试液的制备（4）非水溶液性供试品软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作供试液（1:20）。油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—805–8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯805—8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。29供试液的制备气雾剂，将供试品置冰箱（4--8℃）1h，取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯—80液）此液即为供试品原液。膜剂将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，于45℃±1℃水浴中保温，振摇使溶。茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，振摇30s,以灭菌纱布过滤，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂，制成1:20—1:100供试液。30供试品溶液的制备（5）（含抑菌成分的供试品）稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清液再离心集菌薄膜过滤法：0.45um的滤膜，冲洗3次，每次至少100ml中和法：磺胺类100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml砷、汞类100ml硫乙醇酸盐培养基洗必泰类100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中31供试液的稀释（10倍递增稀释法）10g100ml1:101ml10ml1:1001ml10ml1:1000至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后将吸管放入消毒液缸内。32注平皿在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注2-3个平皿（此时一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。33倒培养基摇合将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂、霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另用YPD琼脂）熔化、冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基，溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。34倒置培养培养细菌计数平板倒置于30-35℃培养箱中培养48h。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23-28℃培养箱中培养72h。35菌落计数细菌数选取平均菌落数在30—300之间的稀释级。霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30—100之间的稀释级。因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。36菌落报告原则如只有1个稀释级平均菌落数在30—300（30--100）之间，则将该稀释级的菌落