实时荧光定量PCR

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。实时荧光定量PCR（FQ－PCR)实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性全程监控，精确定量结果分析更快捷方便，无需电泳荧光定量实时PCR与普通PCR的比较同一样品重复96次的实验结果循环阈值（cyclethreshold,Ct）是在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。00.40.81.21.6201020213040ThresholdBaselineSampleCTCT值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。Ct值的定义在实际操作中，Ct值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著荧光发射时所对应的PCR循环次数。Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数就越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数就越少。正常的Ct值范围在18～30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。Ct值取决于阈值，阈值取决于基线，而基线取决于实验的质量。Ct值和起始模板量的对应关系Templateabundancein6samples.23.823.723.6LowCt,highamount35.635.335.2HighCtlowamount荧光定量PCR的数据分析绝对定量相对定量突变检测等位基因检测＊荧光定量PCR的方法定量可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）X指原始模板绝对定量构建标准曲线：A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。B、克隆有扩增产物的质粒C、利用纯化的扩增产物制备返回CorrelationCoefficient,SlopeandPCREfficiency(cont.)•线性的标准曲线（R20.980或r|–0.990|）•高扩增效率（90-105%）•一致的重复反应E=10–1/斜率相对定量内参基因：Actin,GAPDH,18sRNA靶基因AGAPDHΔCt对照组25.219.55.7实验组22.120.81.31．计算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因－CtGAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt=－4.4。3．计算相对表达量的差值。2－ΔΔCt荧光定量PCR的方法定量可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）X指原始模板目前的定量PCR方法基本上可归为三大类，即外标法、内标法和动力学方法。1.外标准方法在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA）如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量。定量PCR—外标准方法为了定量准确，标准曲线需要5个点以上。需设立重复实验，将误差降到最小，每个样本至少重复3次以上，严格的定量应重复6～8次。需设空白对照、阴性对照和阳性对照。——外标准方法缺点：PCR反应体系的微小区别也会对测定造成较大的影响；扩增效率上的差异会使定量测定精密度和重复性不佳不能排除样本间的差异优点：方法简便，容易建立可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异2.内标法---解决模板提取过程中造成的差别􀂉看家基因􀂉添加DNA或RNA内标法就是将已知浓度的内标准品与待测样本在一管内扩增，然后通过内标的量来计算待测模板核酸的量，从而排除了因管间扩增效率的不同所致的差异。非竞争性内标准（1）与靶核酸无关的基因序列；（2）既可是内源的也可是外源的；（3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列；（4）最常用的是β-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因；竞争性内标准“竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是，与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液相层析等方法区分。对内标准的修饰方法包括对野生型基因组的点突变、部分缺失或插入外来顺序等，目前尚无通用的规则或程序来构建这种内标准。3．动力学方法是一个改良的有限稀释分析方法，即首先将原始模板进行有限稀释，然后对该稀释系列进行PCR扩增，最低的阳性样品被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后阳性样本中相同量的PCR模板。由于不同批次的PCR测定的效率存在差异，因而测定的重复性较差。操作较繁琐。非探针类FQ-PCR内嵌染料-SYBRGreenI引物荧光标记探针类FQ-PCRTaqman探针分子信标（MolecularBeacons）相邻探针（adjacentprobes）阴阳探针荧光定量PCR标记方法DNA结合染料(SYBRGreenI)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission内嵌染料SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenISG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号显著增强。内嵌染料扩增反应中DNA增加，染料结合量增加，荧光信号增强。没有序列特异性，可结合到任何dsDNA上，必需区分目标信号和假信号。（融解曲线分析）SYBRGreenI反应产物的熔点曲线分析引物二聚体对SYBR-Green定量结果的影响TaqMan实验返回RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationQQQExcitation双标记探针（TaqmanProbe）Taqman探针一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3’端连接有荧光淬灭分子。15-25bp，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。DNA聚合酶具外切核酸酶活性，延伸时切除下游探针，使报告染料与淬灭分子分离，荧光信号增加。Taqman探针特点：具有序列特异性，只结合到互补区。每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。适于检测低拷贝数的模板TexasRed,ROXCY3.5,RedmondRed常用的荧光基团FAMTET,VICCY5CY5.5,LC705LC640HEXJOECY3TAMRA荧光定量PCR仪的几个关键部分硬件部分：PCR热循环系统光学检测系统包括：光源、滤光片、放大器、检测器软件部分：校正：荧光干扰/加样误差结果分析：基因表达分析等其它基因扩增技术基本原理优缺点应用其它基因扩增检验技术一、连接酶链反应二、转录依赖的扩增系统三、链替代扩增四、分枝DNA信号放大系统五、杂交捕获系统