实时荧光定量PCR原理及应用

主要内容定量PCR与常规PCR的区别荧光定量PCR的原理常用的热循环仪定量的方法重复性和敏感度应用如何设计荧光定量PCR的方案荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析荧光定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析实时荧光定量PCR的特点特异性更强灵敏度高可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单定量原理PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在实时荧光定量PCR反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。◇基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。◇光域值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。◇CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。几个概念realtimePCR的扩增曲线Ct值极具重现性PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleΔRnThreshold104103102实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是关注的重点。模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。目前最常用的有以下三种定量方法：1.标准曲线法的绝对定量，此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增。标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBRGreenI不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量应用于定量病毒荷载量等2.标准曲线法的相对定量，由于在此方法中对目的基因的是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些看家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果标准品：含有目标基因的DNA或RNA一般选用看家基因校正常选择看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量较常用的一种方法3.比较CT法的相对定量比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物（即看家基因）的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。比较Ct法假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线更为简便省时，也是相当可靠的重复性问题判断实验结果优劣的重要指标主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）影响结果重复性的因素PCR反应扩增的效率优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率目的基因的初始浓度使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔标准曲线的影响5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围理想的标准品应与样本具有高同源性：质粒DNA或是体外合成、转录的RNA影响敏感度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数Mg2＋的浓度应用对各种基因表达进行定量分析基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达差异的检测临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测DNA、mRNA病毒荷载量的定量肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测食品卫生检疫：转基因食品瘟疫流行地区进口的食品点突变分析和等位基因分析单核苷酸多态性（SNP）分析DNA甲基化检测如何设计荧光定量PCR实验方案根据拟要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列（）采用引物设计软件PrimerExpress2.0(Taqman探针或SYBRGreenI，说明见)和beacondesigns3.0进行引物探针的设计软件可在下载PCR产物大小在50-150bpTaqMan探针设计原则保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上5’不能是G尽量使探针中的C多于G上述两条如果不能满足，则使用互补链上的探针对于单探针反应，用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在68-70℃之间，比引物高10℃。长度30bp引物设计原则在探针确定以后再选择引物引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间3’的5个碱基中G和/或C碱基的总数不能超过2个引物和探针的设计原则的重要程度由上往下越来越低如果是设计SYBRGreenI引物，也要选择TaqManPrimerandProbedesign并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在中核实一次，如果发现由非特异性互补区，建议重新设计引物探针。如何设计荧光定量PCR实验方案根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方法，选择荧光素的种类合成引物和探针收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反复冻融）制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）拷贝数=质量÷分子量×6.0×1023标准曲线通常由4～5个点组成配制好的引物和探针，保存于-20℃，注意避光保存探针RT反应如何设计荧光定量PCR实验方案不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔数据分析——基线和阈值的设定确定正确的基线设定合适的阈值注意：同样的实验最好使用同样的基线和阈值，这样可以增加实验的准确性、重复性。但是阈值和基线不能被保存，因此必须记录基线的缺省值在3～15循环阈值的缺省值是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍双击Y轴，将图转化为线图，确定最先出现的反应是否出现在15个循环后，如果是出现在15个循环后，那么不需要调整基线高丰度靶基因经常在PCR循环早期开始扩增需要调整基线的循环终止值先将基线终止循环数定为6，单击Update然后确定第一个检测到扩增的循环数（比第一个检测到扩增的循环数少1或2个循环的数量）将基线终止循环数定为8双击Y轴，将图转化为对数图不正确的基线设置基线终止循环数太低基线终止循环数太高阈值的缺省值是基线荧光信号强度标准偏差的10倍可以将阈值线的光标移到符合下列条件的扩增曲线的位置：指数扩增的线性阶段精度最大敏感性最大常用的荧光定量PCR试剂SYBRGreenITaqman水解探针分子信标SYBRGreenI结合到双链DNA的小沟部位只有和双链DNA结合后才发荧光SYBRGreenI工作原理未结合的SYBRgreenI结合解离曲线识别不同的PCR产物95℃15sec;60℃20sec;95℃15sec在60℃～95℃之间的Ramptime设为19:59SYBRGreenI的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性产物结合解离曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件TaqManProbes荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYLTaqManProbes工作原理探针与目标序列配对时，发生FRET光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等其结果都具有高特异性与高敏感性但只适合于一个特定的目标TaqManMGB探针荧光素非荧光淬灭基团与目标序列互补MGB(MinorGrooveBinder)将探针的Tm值提高10℃因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补淬灭剂茎(5-7bp)环（15-30bp）FAMTexasRed分子信标工作原理探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA模板淬灭剂茎环光淬灭分子信标