第12篇 抗生素类药物分析

第十一章抗生素类药物的分析第一节概述一、抗生素药物的特点抗生素的定义在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称.抗生素的来源1.生物合成（发酵）2.化学合成或半合成与化药相比,其结构、组成更复杂表现为:化学纯度较低(同系物多,异构体多,降解物多)活性组分易发生变异稳定性差抗生素药物的质量分析分析项目：鉴别，检查，含量测定分析方法：理化方法，生物学方法(一)鉴别试验（主要为理化方法）1.官能团的显色反应2.光谱法(IR,UV)3.色谱法4.生物学法(二)检查1.影响产品稳定性的指标2.控制有机和无机杂质的指标3.与临床安全性密切相关的指标4.其他指标(三)含量测定或效价测定1.微生物检定法测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点:（1）测定原理与临床应用一致，反映医疗价值。（2）灵敏度高，检品甚微。（3）适用范围广，精制品、纯度差制品、新发现、已知的都适用。（4）同一类抗生素不需分离，一次测定总效价。缺点1、操作繁琐2、培养时间长（16～24h）2、测定误差大（±10％）（二）化学及物理化学方法以理化方法测定主药含量优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰分类（按结构与性质）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类蒽环类、其他抗生素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第二节β–内酰胺类抗生素包括:青霉素族和头孢菌素族,分子结构均含有β–内酰胺环1、结构青霉素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO头孢菌素类＊＊＊＊＊青霉素族和头孢菌素族分子都有一个游离羧基和酰胺侧链。氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β–内酰胺环并合的杂环,分别构成二者的母核.6-APA7-ACA青霉素分子中含有三个手性碳原子(C3,C5,C6),头孢菌素族分子两个手性碳原子(C6,C7),青霉素分子中的母核称为6-氨基青霉烷酸(6-APA),头孢菌素族分子中的母核称为7-氨基头孢菌烷酸(7-ACA)（青霉素，青霉素G、苄青霉素）通常以钾盐，钠盐形式存在CONSOHNCOOHCH3CH3CH2普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林（氨苄青霉素）或以钠盐形式存在阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2头孢拉啶（注意取代基非苯环）CH2NH2CONONHSCH3COOH头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONaNSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性2、性质与碱金属(Na+、K+)成盐易溶于水,遇酸则析出游离基的白色沉淀（1）羧基Na与有机碱(普鲁卡因)成盐，难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO1234567（2）手性C87654321NOS头孢菌素类C6C7青霉素类C3C5C6旋光性根据此性质，可用于鉴别和含量测定（3）共轭体系NSO头孢菌素类母核有共轭体系O=C-N-C=C青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基NOSUV（四）β–内酰胺环的不稳定性干燥纯净稳定室温密封可以保存3年以上水溶液不稳定随PH和温度有很大变化。青霉素水溶液在PH6-6.8时较稳定本类药物在酸，碱，青霉素酶，羟胺，及某些金属离子（铜，铅，汞，银）或氧化剂等作用下，易发生水解和分子重排原因：四元环张力大酰胺键易水解含水量和纯度青霉素的降解反应1.青霉素在pH2酸性条件下生成青霉酸，青霉酸在酸性条件下，100℃降解成青霉醛，青霉胺和CO22.青霉素在pH4酸性条件下生成青霉烯酸3.青霉素在碱性条件下或青霉素酶作用生成青霉噻唑酸（β–内酰胺环的酰胺键发生断裂），青霉噻唑酸在氯化汞作用生成青霉醛，青霉胺和CO24.青霉素与NH2OH生成α–青霉噻唑酰基羟胺酸失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶二.鉴别试验（一）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOHHClNOHH内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+H+开环NSONSCOHNHOHH2NOHHClNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3呈色例：ChP(2005)头孢哌酮[鉴别]取本品10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液[取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液1份，乙醇4份]3ml，振摇溶解后，放置5min，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22.类似肽键的反应A.茚三酮反应α-氨基蓝紫色氨基茚三酮△α-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RCOH2RCHH2NCOOH2OHCCOCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCOCONH紫内酰胺类碱性酒石酸铜（开环分解）似肽键B.双缩脲反应β-内酰胺类2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH蓝紫色3.其他显色反应(1).与变色酸-硫酸反应青霉素阿莫西林氨苄西林活泼“-CH2-”HCHOCHSOH”羰基侧链含“△（分解）变色酸显色NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2变色酸阿莫西林HCHOSOH150℃（缩合）色褐SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）(2).与H2SO4-HNO3反应亮黄红棕黄色头孢噻肟钠头孢噻吩钠头孢氨苄HNOSOH头孢菌素类(3).与重氮苯磺酸反应头孢哌酮橙黄色重氮苯磺酸OHHC（偶合）酚羟基SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNNCH3NClNNaO3SOH（偶合）NNNNCH3SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNaO3S(4).与铜盐反应CuSOHAc头孢氨苄橄榄绿色NaOH专属反应（二）K+、Na+反应焰色→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓黄Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼钠+HAc→↓白K+（三）沉淀反应1.遇酸→↓白青霉素青霉素钠　青霉素钾　H在过量HCl或有机溶剂中溶解青霉素钾或钠盐，加水溶解后，加稀盐酸，即析出难溶于水的游离基白色沉淀，此沉淀能在有机溶剂或过量盐酸（与酰胺基成盐）中溶解2.有机胺盐反应⑴重氮化-偶合反应青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素H重氮化-偶合反应红芳伯氨基C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCH+C2H52CH2NH2H2NCOOCH2CH2N普鲁卡因普鲁卡因青霉素NCH2CH2OOC2C2H5N+Cl-N2C2H5COOCH2CH2NNH2HClNaNO2（2）与三硝基苯酚反应三硝基苯酚二苄基乙二胺苄星青霉素NaOH△二苄基乙二胺二苄基乙二胺苦味酸盐mp三硝基苯酚H2OHOH-HCONSOHNCOOHCH3CH3CH2CH2NCH2CH2NHCH2OHNO2O2NNO2CH2NCH2CH2NHCH2酚四.光谱法1.UV法利用最大吸收波长法根据吸收光谱的最大吸收波长进行鉴别。2.IR法反应分子的结构特征，各国药典均采用IR对抗生素类药物进行鉴别色谱法（五）1、TLC法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR2、HPLC法Rt比较供试品对照品相同条件三特殊杂质检查特殊杂质：高分子聚合物，有关物质，异构体采用方法：HPLC法控制限量也有测定杂质的吸收度控制杂质的量HPLC法（四）含量测定方法ChP特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）第三节氨基糖苷类抗生素苷苷元糖缩合氨基糖苷苷元氨基糖缩合链霉素庆大霉素卡那霉素新霉素巴龙霉素（碱性环己多元醇）链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺苷元糖链霉双糖胺一.化学结构与性质1.化学结构链霉素NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺Pka11.5Pka7.7庆大霉素糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺糖紫素胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺ROCR1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺Pka8庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H2、性质多与硫酸成盐链霉素3个庆大霉素5个碱性中心碱性与溶解性（一）硫酸盐易溶于水，不溶于有机溶剂(二)旋光性(分子结构含有多个氨基糖)（三）苷的水解与稳定性链霉素的硫酸盐水溶液，一般以pH5-7.5最为稳定，过酸或过碱条件下易水解失效；在酸性条件下，链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺，进一步水解生成N-甲基-L-葡萄糖胺在碱性条件下，链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺，并使链霉糖部分发生分子重排，生成麦芽酚，为链霉素所特有，可以用于鉴别和含量测定氧化还原性：链霉素分子结构中具有醛基，遇氧化剂如：高锰酸钾、氯酸钾、过氧化氢等易被氧化成链霉酸而失效；遇还原剂如：Vc、葡萄糖、半光氨酸等被还原为双氢链霉素，毒性增加硫酸庆大霉素:对光，热，空气均较稳定，水溶液亦稳定，PH2-12时，100℃加热30min活性无明显变化（四）紫外吸收光谱链霉素在230nm有紫外吸收，庆大霉素没有紫外吸收。NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应（五）链霉素水解产物反应茚三酮反应（一）本类抗生素具有氨基糖苷结构，具有羟基胺类或者氨基酸的性质，可以与茚三酮缩合成蓝紫色化合物二鉴别试验（共有反应）N-甲基葡萄糖胺反应（二）甲基葡萄糖胺链霉素水解N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱红色缩合物（Elson-Morgan反应）庆大霉素（共有的反应）NHCH3NHNHNHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNCH3COCH3HHOCH2CHOH3(缩合)323COCHCOCHCHOHHHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3N樱红色对二甲氨基苯甲醛H+NCH3COCH3HHOCH2CHOH3麦芽酚反应（三）（链霉素特有反应）链霉糖链霉素OH麦芽酚紫红色3FeH+分子重排NHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2ONaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红麦芽酚链霉胍特有反应NOH8-羟基喹啉坂口反应（四）α-萘酚OH链霉素加氢氧化钠水解生成链霉胍，链霉胍和8-羟基喹啉（或α－萘酚）分别与次溴酸钠反应，各自产物相互作用生成橙红色化合物白BaSOSOBaH+IR法（七）庆大霉素无UV吸收nmmax链霉素TLC、HPLC法（八）(五)硫酸盐反应(六)UV链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）链霉素分子中的N-甲基-L-葡萄糖胺的C4位上羟基连接1个D-甘露糖2.方法TLC中的对照品法（BP）1.来源反应中间体三、特殊杂质检查及组分分析对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的