人类细胞质、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用

人类细胞质、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物RNA提取的原理在哺乳动物中，rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外）在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的方法Trizol法Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。Trizol法Trizol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。Trizol法Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。RNA提取的一般步骤破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行•可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织•加入β-ME可以抑制RNA酶活性2、分离RNA•一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。3、沉淀RNA•一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、融解RNA一般使用TE(缓冲液）。6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳度有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的种方法。琼脂糖凝胶电泳的应用分离不同片段大小和不同构象的DNA、RNA分子鉴定DNA的片段，如PCR产物的鉴定纯化DNA分子2020/2/12琼脂糖凝胶电泳凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照2020/2/12人类细胞质RNA提取完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是RNase。RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。RT-PCRRT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。是一快速、简便、敏感性极高的检测RNA的方法。RT-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR的应用分析基因的转录产物获取目的基因合成cDNA探针构建RNA高效转录系统2020/2/12RT-PCR的步骤提取原理、方法逆转录酶、引物提取总RNA合成cDNA原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳提取总RNA合成cDNAPCR电泳逆转录酶：存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC。以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。逆转录反应(RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h•RTRT-PCR的逆转录酶逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.常用的逆转录酶有两种：鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV)反转录酶莫罗尼鼠类白血病病毒（MMLV)反转录酶合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。合成cDNA引物的选择2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。合成cDNA引物的选择3．异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。PCRPCR技术(olymerasechainreaction)：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以Marker(分子质量标准)作为参照，用≤5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。结果初步分析数量分析：条带的宽度，荧光的亮度。质量分析：纯度分子量