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1.2基因工程的基本操作程序四个基本步骤：步骤一：目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。•目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。与RNA聚合酶结合位点原核细胞的基因结构编码区非编码区（补充知识）基因的结构1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游能够编码蛋白质的序列不能够编码蛋白质的序列内含子：外显子：某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库直接分离基因基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因基因文库基因组文库部分基因文库如：cDNA文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成•哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。利用PCR技术扩增目的基因•又称聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。引物5’5’3’3’Mullis的构思特定DNA片段5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020DNA聚合酶？耐热①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）聚合酶链式反应体外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2nDNA复制在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链⑤反应过程：a.变性(90～95℃):b.退火(55～60℃):c.延伸(70～75℃):DNA模板解链引物与模板结合，形成局部双链PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。•多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）•A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现•B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成•C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸•D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性例：根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记。第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上。然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。第三步，按DNA杂交的方法进行杂交。第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因。第五步，从该菌落中再提取目的基因。PCR技术扩增DNA,需要的条件是（）①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥A获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）A、从基因组文库中获取B、从cDNA文库中获取C、从含目的基因生物细胞中获取D、利用PCR技术获取C二、基因表达载体的构建——基因工程的核心目的：组成：1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代，2、使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录启动子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来标记基因：有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。•2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是•A．追踪目的基因在细胞内的复制过程•B．追踪目的基因插入到染色体上的位置•C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布•D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构。C三、将目的基因导入受体细胞转化—目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理（3）适用范围感染双子叶植物和裸子植物具有趋化性（酚）紫花中的紫色物质是一种天然的优质色素，但由于B基因表达的酶较少，紫色物质含量较低。设想通过基因工程技术，采用重组的Ti质粒转移一段DNA进入细胞并且整合到染色体上，以促进B基因在花瓣细胞中的表达，提高紫色物质含量。右图是一个已插入外源DNA片段的重组Ti质粒载体结构模式图，请填出标号所示结构的名称：①②③①T-DNA②标记基因③复制原点基因枪法2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：细菌0℃二价阳离子Ca2+、Mg2+42℃用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定检测—鉴定——④检测基因表达载体是否进入了受体细胞③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等——检查是否成功②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.对含目的基因的DNA片段作放射性同位素标记，以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中方法:DNA分子杂交②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:分子杂交方法:抗原---抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA.鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。•继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：•（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是____________________。•（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入__________中，原因______________________•（3）通常采用____________________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。•（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的__________细胞中特异表达。显微注射受精卵受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达。DNA分子杂交膀胱上皮（或早期胚胎）思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠