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1现代中药提取与纯化技术一、中药提取与纯化技术（一）不同制备工艺对中药有效成分的影响及药物成分分析在中药口服液生产中经常采用水提醇沉法或醇提水沉汉来去除杂质，但在醇沉或水沉过程中极易使有效成分损失且澄明度指标不合适，近年有了絮凝法，但仍不十分理想，影响药效。中药有效成分分子量0均较小，约大多数在1000以下，而无效成分分子量较大，大多50000以上，这些高分子杂质具有亲水基和疏水基，其水溶液为胶体溶液。传统工艺中渗漉法的冷冻静置过程就是胶体溶液的破坏过程，使高分子杂质沉淀析出，而醇沉法则通过加入乙醇而改变高分子杂质的亲水性，使其沉淀，乙醇浓度愈高，沉淀的次数愈多，杂质去除的越完全，但有效成分损失的就越大。超滤技术是利用物理筛分的原理，用多孔半透膜（超滤膜）为介质，以错流方式进行过滤，利用膜孔选择性的筛分作用对物质进行截留，使溶质与低分子物质通过，高分子物质不能通过，从而达到分离纯化的目的。近年来已民用工业将超滤法应用到中药口服液制剂工艺中的探索，本文对用醇沉法、渗漉法和超滤法生产的口吸取制剂进行成分对比分析。本文还尝试采用色谱——质谱联用技术（GC－MS，HPLC－MS）对中药液中的药效成分进行分析，作为工艺比较的又一参考。色—质联用的特点是：1）色谱仪是质谱仪的理想的“进样器”，试样经色谱分离后以纯物质形工进人质谱仪。2）质谱仪是色谱仪的理想的“检测器”，质谱仪能检出进样中几乎全部化合物，灵敏度高。此技术适用于多组分混合物中未知组分的定性鉴别，可以判断化合物的分子结构，准确测定未知组分的相对分子质量等。中药液成分十分复杂，其种类、组成很难确知，因此应用此方法有可能分析出药液的全成分，不仅对工艺控制有指导意义，而且有利于中药的配伍研究。已有将色谱—质谱联用技术用于中经中某种已知成分或同系物的单组分分析，尚无将色谱－质谱联用技术用于中药液组分分析的报道。1、实验方法1.1仪器与试剂：试剂均用分析纯，蜂乳精口服液某厂提供），HP5890Ⅱ气相色谱仪，HP5971A质谱仪，超滤膜，抗病毒口服液（某公司提供），5μL进样器，CAMAG展工槽（瑞士），岛津GC－910薄层扫描仪，高效硅胶G板10cm×10cm（青岛海洋化工厂），硅藻土G（宁波向阳化工厂）。1.2实验方法：分别用醇沉法和超滤法处理抗病毒口服液，对制得的产品用色谱－质谱联用技术进行分析比较；分别用渗漉法和超滤法处理蜂乳精口服液，用薄层层析法分析其中有效成分，并进行比较。2工艺流程如下：a.醇沉法：药材煎煮→醇沉（冷冻静置24～28h）→收醇→过滤→配制→过滤→复滤→复滤→灌封b.渗漉法：酊剂→半成品配制（5℃以下静置15d）→过滤→成品配制→（5℃以下静置15d）→过滤→复滤→灌封c.超滤法：药液配制→粗滤→超滤→灌封2、结果2.1醇沉法和超滤法结果比较：CG－MS分析结果见表1。表1抗病毒口服液化学成分比较序号保留时间（min）化合物原工艺（%）新工艺（%）分子式1234567892.3352.8453.3466.3436.6627.2338.428.59111.081－羟基2－丙酮2－甲基丙酸甲酯2－糠醛6－甲基3，5－二羟基2，3－二氧化四氢吡喃苯甲酸5－羟基－2－糠醛1－组氨酸乙酯4－氨基噻吩醇1－萘乙酸--2.335.109.9322.4---2.853.85.575.5410.431.41.041.70.46C3H602C5H1002C5H402C6H804C7H602C6H603C8H13N302C6H7NSC12H1002注：9个保留时间所显示出种物质含量较多，余者含量较低，暂不做比较。由表1可知：1）在醇沉过程中9种主要有效成分中的5种成分消失了，而其它4种成分亦有不同程度的损失。2）在保留时间7.233min时，两者均有最大含量，新工艺为31.4%，而原工艺仅为22.4%，新工艺提高了40.18%。由此结果并结合文献的结论可以提出超滤法能有效地保留药效成分并保证产品质量，药液澄清透明，保抽期内不沉淀。2.2渗漉法和超滤法结果比较：见表2。蜂乳精口服液的有效成分为10—HAD和人参皂苷，采用薄层层析法分析。采用超滤技术的新工艺比老工艺样品中的10—HAD含量高一倍，样品2比样品3高10%，样品3比样品4高近10%，样品2是样品1含量的2.24%倍。原工艺生产的口服液存在沉淀问题，用新工艺生产的口服液久置不沉淀，解决了口服液沉淀问题。表2蜂乳精样品中标示有效成分含量3样品含量10－HAD（μg/μL）人参皂甙（mg/10ml）样品含量10－HAD（μg/μL）人参皂甙（mg/10ml）120.13380.29980.0150.147340.27120.24860.155未检出1—为渗漉工艺生产的蜂乳精口服液，2—为原液，3—为超滤新工艺，4—为新工艺浓缩液。3、结论3.1超滤法制备的口服液可充分保留药液的有效成分，保证了成分含量的稳定性，使制剂生产厂能对制剂的成分含量进行标示。超滤法节约了大量能源与乙醇，生产效率提高，生产周期缩短，明显提高生产能力。3.2本文采用的是气相色谱仪，故可能仍有部分有效成分不易气化而未被检出。尽管如此，色谱—质谱联用技术用于中药液有效成分分析的结果仍然对未知成分的确定有指导意义。（二）层析技术在中药化学中的应用层析技术的应用与发展，对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）。目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善。一．层析法的基本原理：层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析，流动相为液体的称为液相层析。一、吸附层析法（AdsorptionChromatography）（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。1．吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。（1）硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热4至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须5选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化