猪I型与II型干扰素的克隆-生物谷-生物医药门户

生物工程学报ChinJBiotech2009,June25;25(6):806-8[e-mail]©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:March18,2009;Accepted:April21,2009Supportedby:MinistryofScienceandTechnologyofChinaProgram(No.2006BAD06A04),HundredsofTalentsProgramofChineseAcademyofSciences.Correspondingauthor:WenjunLiu.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]国家科技支撑计划(No.2006BAD06A04),中国科学院百人计划资助。动物及兽医生物技术相讥猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较陈雪梅,薛清华,祝荣格,付显华,杨利敏,孙蕾,刘文军中国科学院病原微生物及免疫学重点实验室中国科学院微生物研究所分子病毒中心,北京100101摘要:干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质,主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)、、及基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-、pET-His/PoIFN-、pET-His/PoIFN-和pET-His/PoIFN-,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明猪和融合干扰素有较为显著的抗病毒活性,抗PRRSV活性高达108U/mg;猪干扰素活性效价约为干扰素的1/2到1/3;猪干扰素几乎未检测到抗病毒活性,需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。关键词:猪干扰素,抗病毒活性ComparisonofantiviralactivitiesofporcineinterferontypeIandtypeIIXuemeiChen,QinghuaXue,RonggeZhu,XianhuaFu,LiminYang,LeiSun,andWenjunLiuChineseAcademyofSciencesKeyLaboratoryofPathogenicMicrobiologyandImmunology,CenterforMolecularVirology,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,ChinaAbstract:Interferons(IFNs)arenaturalproteinsproducedbywidevarietyofcellsinresponsetoviralinfectionorotherbiologicalinducers,andtheyexecutediversifiedfunctionsasantiviraldefense,immuneactivationandcellgrowthregulation.Fourgenesencodingporcineinterferons(PoIFN),PoIFN-α,PoIFN-γ,PoIFN-αγorPoIFN-ω,wereclonedandsequenced.ThefourtypesofporcineinterferongenesweresubclonedintothepET-Hisvector,andexpressedinEscherichiacoliRosetta(DE3).Therecombinantproductswerepurifiedandrenaturalizedfrominclusionbodiestoobtainanativestateofwellbiologicalactivity.Antiviralactivityassaysforporcineinterferonswereperformedandevaluatedbystandardproceduresinfollowingcell/virustestsystems:Marc-145/PRRSV,Marc-145/VSV,PK-15/VSV,Vero/VSVorMDBK/VSV.ThedatashowedthatbothPoIFN-αandPoIFN-αγdemonstratedsignificantantiviralactivities,andthetiterofthemagainstPRRSVwasupto108U/mg.PoIFN-γhadapproximatelyhalforone-thirdsantiviralactivityofPoIFN-α.PoIFN-ωshowedinconspicuousantiviralactivity.Keywords:porcineinterferon,antiviralactivity陈雪梅等:猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较807Journals.im.ac.cn干扰素是人或动物细胞受到病毒感染等刺激后由巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞产生的一类多功能细胞因子,是天然免疫反应的重要成分。根据其抗原特性、分子序列结构的差异,干扰素可分为3大类:I型、II型和Ⅲ型。I型干扰素缺少内含子,包括IFN-､､､､､､､等多个亚型,主要功能为“抗病毒细胞因子”;II型干扰素即IFN-,又称为免疫干扰素;最近在人、鼠、鸟和鱼中新发现了Ⅲ型干扰素,包括IFN-1、IFN-2和IFN-3[1–4]。1985年,Hauptmann和Swetly首先从人淋巴瘤cDNA中发现了干扰素基因[5],该基因被认为是在116~132万年前从干扰素基因进化而来[6]。目前研究发现干扰素基因在各种哺乳动物中广泛存在,如山羊、绵羊、牛、马、兔和猫等[2,7],但在犬基因组中该基因缺失[8]｡1991年,Mege发现了5个猪干扰素基因,其中2个是假基因,另外3个可编码功能蛋白[9]。我国是养猪大国,猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗,仍不能有效控制疾病流行。动物用基因工程干扰素具有无药物残留、无副作用等特点,属于新型的蛋白质类兽药。干扰素通过激活细胞中多种功能基因的转录,调节各信号传导通路的协同作用,能够发挥广谱抗病毒、调节免疫细胞以及免疫调节等多种生物学功能,对体外抑制多种病毒的增殖,已初见成效[10,11]。因此研究开发这种新型的抗感染药物具有积极的现实意义。本实验克隆、表达及纯化了猪干扰素PoIFN-、PoIFN-、PoIFN-和PoIFN-,并用细胞病变抑制法详细比较了4种猪源干扰素在不同细胞系上,对不同病毒的抗病毒活性。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒大肠杆菌DH5、Rosetta(DE3)为本实验室保存;pMD18-T载体购自TaKaRa公司;pET-His表达载体购自基因动力公司。1.1.2细胞系、病毒株牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、猴肾细胞(Marc-145)、猪肾细胞(PK-15);水泡性口炎病毒(VSV)、猪繁殖与呼吸综合征病病毒(PRRSV)由本实验室保存。1.1.3试剂、引物各种工具酶购自TaKaRa公司;Trizol试剂、superscriptTMIIIfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司;Ni-NTA纯化柱购自QIAGEN公司;DMEM细胞培养基购自Gibco公司;质粒提取和胶回收试剂盒为Promega生物技术公司产品。引物由上海生工公司合成;测序由上海生工公司完成。1.2方法1.2.1提取总RNA、RT-PCR合成cDNA以Trizol试剂法分别从猪外周血细胞、被VSV感染12h后的PK-15细胞中提取总RNA。以总RNA为模板,用InvitrogensuperscriptTMⅢfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。1.2.2PCR扩增目的基因、T载体的构建分别根据GenBank公布的猪干扰素(AccessionNo.M28623)、猪干扰素(AccessionNo.EU249804)序列,以猪外周血细胞cDNA为模板,PCR扩增PoIFN-和PoIFN-基因成熟区序列;设计融合引物,以PoIFN-与PoIFN-基因成熟区序列为模板,PCR扩增其融合基因,即PoIFN-,为保证融合基因所编码蛋白的正确空间构象和正常生物学活性,在2个基因中间808ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechJune25,2009Vol.25No.6Journals.im.ac.cn引入了短核苷酸链“ggcgggggtggcagcggtggcgggggatca”,编码氨基酸“GGGGSGGGGS”;根据猪干扰素序列(GenBank上定义为S.scrofadomesticaPoIFN-alphaⅡ-5gene,AccessionNo.X57196),以病毒感染的PK-15细胞cDNA为模板,PCR扩增PoIFN-基因成熟区序列。上述引物均引入了BamHI和HindIII酶切位点(表1)。将PoIFN-、PoIFN-、PoIFN-和PoIFN-的PCR纯化产物分别亚克隆入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,经BamHI和HindIII双酶切鉴定正确后,送上海生工公司测序。1.2.3PoIFN-序列分析用MegAlign程序对已获得的PoIFN-基因与GenBank数据库中其他干扰素基因经ClustalW法比对,并构建核苷酸和蛋白质序列进化树。表1克隆目的基因PoIFN-、PoIFN-、PoIFN-和PoIFN-的引物Table1PrimersforcloningoftargetgenesGenesPrimersPrimersequences(5′3′)PoIFN-ForwardcgcggatccatgtgtgacctgcctcagacccReversecccaagcttactccttcttcctgagtctgtctPoIFN-ForwardcgcggatccatgtcttactgccaggcgccctttReversecccaagcttattttgatgctctctggccttPoIFN-ForwardcgcggatccatgtgtgacctgtctcagaaReversecccaagcttaggatgaccccaggtctacPoIFN-ForwardcgcggatccatgtgtgacctgcctcagacccFusion-reverseccgccaccgctgccacccccgccctccttcttcctgagFusion-forwardtggcagcggtggcgggggatcatcttactgccaggcgcReversecccaagcttattttgatgctctctggcctt1.2.4原核表达质粒pET-His/PoIFN-、pET-His/PoIFN-、pET-His/PoIFN-和pET-His/PoIFN-的构建及表达将测序正确的重组质粒pMD18/PoIFN-、pMD1