生化药物质量标准中的生物检定及其进展

生化药物质量标准中的生物检定及其进展中国药品生物制品检定所李湛军生物检定（bioassay）一些生化药物质量标准中有生物活性测定安全性检查（多组分生化药的原材料来源于人、动物的组织或者体液，或者通过发酵而来。其组分不明确、按照化学药品的质控方式很难控制其质量）多组分生化药注射剂基本技术要求：涉及到多组分生化药特性的指标应订入质量标准，如过敏物质、降压物质、异常毒性等。活性测定也是反映产品质量的重要指标，有时比含量测定更具专属性，建议将活性测定收入标准生物检定（bioassay）按生物体分类：体内测定(invivo)---整体动物体外测定(invitro)---离体器官、组织，微生物、酶和细胞（原代细胞、传代细胞）中国药典2005版二部中的生物检定用于生物活性测定的生化药物有21品种（约占我国生化药的10%）安全性检查---很多生化药物（无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等）生物检定针对的品种---多组分生化药对无适当理化方法检定、常规化学测定方法较难建立，不能控制其质量的药品生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性当前英国、美国及中国药典都有收载生物检定的重要作用新药研发初始阶段(体外测定筛选有效成分、整体动物试验确认药效)生产阶段：评价产品批与批之间稳定性和一致性生产工艺验证（生物检定可监测不曾预料、不易发现的构象变化，它是所有变化的综合效应）生产工艺验证的品种DNA重组人生长激素、人胰岛素、人胰高血糖素，降钙素等常规检定已用理化测定（HPLC）药典（BP、ChP）规定：在研发阶段，生产过程中的产品必须用体内生物测定方法测定其生物效价，直到生产稳定为止活性测定分类活性测定---定量：质量标准中生物效价测定（HCG、HMG、肝素）---半定量---定性活性测定------半定量半定量------当理化测定占主导地位，生物效价测定降为辅助作用，只用于活性检查，设定限值，采用半定量方法，不需精确的生物统计，尽可能减少实验动物用量如治疗二型糖尿病新药重组人胰高血糖素类多肽-1（7-36）质量标准中采用半定量方法（限值为小鼠血糖降低应大于20%）进行活性检查活性测定------定性定性（鉴别Identity）对质量控制能用理化测定的产品，生物测定从主导地位的定量测定降为次要的鉴别项的定性测定，只用较少的动物例如USP29版：缩宫素（oxytocin）子宫收缩法用于鉴别；升压素（Vasopressin）大鼠血压升高法用于鉴别，效价测定均采用HPLC法ChP2005版二部缩宫素仍用定量生物测定法生化药标准中的体内生物检定（1）生化药名生测方法应用收载标准HMG尿促性素FSH大鼠卵巢增重法LH大鼠精囊增重法鉴别效价测定ChP2005HCG绒促性素雌幼小鼠子宫增重法效价测定ChP2005垂体后叶大鼠血压升高法效价测定ChP2005促皮质素大鼠肾上腺内维C降低效价测定14th册地标升国标小牛脾提取物家兔升高白细胞法活性检查9th册灵杆菌多糖家兔升高白细胞法活性检查9th册生化药标准中的体内生物检定（2）生化药名生测方法应用收载标准rhGH重组人生长激素去垂体大鼠体重法和胫骨法工艺验证ChP2005降钙素大鼠血钙法工艺验证ChP2005孕马血清促性腺激素雌幼大鼠卵巢增重法效价测定BP2007升压素大鼠血压升高法鉴别USP29人胰高血糖素兔血糖升高法工艺验证BP2007人红细胞生成素小鼠网织红细胞计数效价测定ChP2005生化药标准中的体外生物检定（1）离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法生化药名生测方法应用收载标准缩宫素大鼠子宫收缩法效价测定鉴别ChP2005USP29肝素家兔血，兔、猪血浆凝固法效价测定ChP2005低分子肝素酶促反应的分光光度法效价测定BP2005硫酸鱼精蛋白家兔血，兔猪血浆凝固法效价测定ChP2005甘露聚糖肽补体结合法检查免疫原性16th册地标升国标生化药标准中的体外生物检定（2）离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法生化药名生测方法应用收载标准胸腺肽脱E受体法活性检查16th册地标升国标转移因子脱E受体法活性检查16th册抗肿瘤免疫核糖核酸小鼠脾细胞黏附率法活性检查16th册抗乙肝免疫核糖核酸小鼠脾细胞黏附率法活性检查16th册促肝细胞生长素SMMC-7721肝癌细胞增殖MTT比色法活性检查9th册牛胎肝提取物SMMC-7721肝癌细胞增殖MTT比色法活性检查9th册基因重组技术产品体外生物检定多采用相对快速重复性好的细胞培养测定法，收载ChP2005生化药名生测方法原理应用干扰素（IFN）Wish细胞病变抑制/结晶紫染色法间接保护细胞效价测定粒细胞集落刺激因子（G-CSF）NFS-60细胞/MTT比色法促进细胞生长效价测定粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF）TF-1细胞/MTT比色法促进细胞生长效价测定表皮生长因子（EGF）3T3细胞/MTT比色法促进细胞生长效价测定白细胞介素-2（IL-2）CTLL-2细胞/MTT比色法促进细胞生长效价测定肿瘤坏死因子（TNF）L929细胞/结晶紫染色法抑制细胞生长效价测定碱性成纤维细胞生长因子（bＦＧＦ）3T3细胞/MTT染色法促进细胞生长效价测定实验设计与生物统计生物测定（无论体内、体外）的实验误差比理化测定要大控制实验误差尤为重要试验控制（良好实验操作、试验材料一致性）合理的实验设计运用生物统计例如肝素含片质量标准（9th册地标升国标）内为低分子肝素:LMWH，对FXa效价测定采用体外酶促反应的分光光度法实验设计为标准曲线法对其相关系数（r）和每一浓度重复次数均未作要求本实验室增加要求r0.98和每一浓度至少重复2次对同一批号肝素含片产品测定其抗FXa效价，结果误差仍大，重现性差，波动大，缺乏可比性改为量反应平行线原理的4·4实验设计并结合生物统计要求实验可靠性测验通过：直线回归P0.01，偏离平行、二次曲线和反向二次曲线P0.05P结果较平稳，误差小，重现性好肝素含片内LMWH不是化学纯品，是一定分子量范围内的多相性成分的分布，其相对分子量、糖链长度、硫酸化数目和位置、结构的不均一性对显色反应的分光光度法均有一定误差正确的实验设计并运用生物统计提高实验的准确度和精密度809010011012013014013579实验次数n实测值是标示量的%标准曲线法4•4法标准曲线法与量反应平行线4·4法测定同一批肝素含片产品抗FXa效价比较生物检定进展科技发展，一些生化药已由现代生物技术（DNA重组、生物合成等）获得检测技术、结构分析水平的提高产品纯度生产工艺的成熟、完善，产品达到高纯生物测定繁琐、实验周期长、准确度差、误差大、耗费大量人力、物力随着对动物保护、对实验动物减少、替代、优化（3R）的呼声越来越高，生物测定已不适应现代科学技术的发展发展趋势减少实验动物用量、降低实验费用缩短实验周期，提高实验准确度、精密度和稳定性检测方法的invitro代替invivo简单代替繁琐生物测定正从主导地位的定量测定降为辅助作用的半定量、定性测定，直至被取代胰岛素（动物胰腺提取）生物检定USP29版胰岛素生物鉴别试验(Bioidentitytest)半定量的8只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL组，每组2只），生物效价不得低于15USPU/mg定量的生物效价测定需用24只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL组，每组6只）定量法用于胰岛素标准品标定、新制剂稳定性的考察、胰岛素类似物特异性活性的测定，而不用于常规检定BP2007版胰岛素采用HPLC法ChP2005版二部，动物胰腺提取的胰岛素定量生物测定中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目1、药品中氨基酸分析方法的研究（归纳分类）。（中检所负责）2、蛋白质含量测定方法的规范化研究，增订附录。（上海所负责）3、人工肠液和胃液中所用酶试剂的标准化研究。（中检所和北京所负责）4、缩宫素、降钙素等品种用HPLC法替代生物测定法的研究。（各品种起草单位）。5、等电聚焦电泳法的规范化研究，增订附录（中检所负责）6、体外生物活性测定法标准化研究。（中检所负责）7、多合成肽（8、14、28、3、4、9肽）的相关物、不相关物的分析。（中检所负责）8、硫酸软骨素、香菇多糖、低分子肝素等多糖类药物的分子量及分布的标准物质的研究。（中检所）9、多烯酸乙酯的相关物、不相关物的分析。（北京所）10、氨基酸原料药中其他氨基酸检查方法的考察。（河南所牵头，中检所复核，各品种起草单位参加）中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目11、降压物质（组胺、类组胺）质谱检测与动物实验相关性的研究。（中检所负责，上海所、广州所、天津所参与）12、应用PCR对人源性药品原材料残留病毒核酸的研究。（中山大学负责）13、生化药注射剂、滴眼剂的可见异物检查研究。（北京所牵头，各品种起草单位参加）14、生化药品过敏原的研究。（中检所负责）15、辅酶AHPLC法与效价测定法的相关验证。（河南所负责）16、磷测定方法的方法学研究。（上海所负责）17、多酶片的质量标准提高。（陕西所负责）18、复方氨基酸注射液等输液中铝元素考察及检查方法的建立。（辽宁所牵头）19、修订分子排阻色谱法中生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法（增订普适校正法和宽分布标样法）。（中检所）在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性（P﹤0.01）的品种生化药名生物测定方法理化测定方法收载质量标准rhGH重组人生长激素去脑垂体大鼠的体重法和胫骨法HPLCChP2005BP2007重组人胰岛素小鼠或家兔血糖法HPLCChP2005BP2007降钙素大鼠血钙法HPLCChP2005BP2007低分子肝素血浆凝固法或家兔全血凝固法分光光度法BP2007在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性（P﹤0.01）的品种生化药名生物测定方法理化测定方法收载标准伟素(Sulodexide)大鼠血脂清除率法分光光度法企业标准重组绒促性素(rHCG)幼小鼠子宫增重法HPLC企业标准重组卵泡刺激素(rFSH)幼大鼠卵巢增重法HPLC企业标准重组黄体生成素(rLH)幼大鼠精囊增重法HPLC企业标准发展方向取代在今后药品质量标准中生物测定逐渐被先进的理化方法、或能保证临床用药安全有效的其它方法所取代，或只存在于生产研究阶段WHO国际药典及药品专家委员会第42次专家会议(2007年10月)讨论对于胰岛素、缩宫素等由原来生物测定转化为理化测定的提议安全性检查（safetytest）一般原则：注射液为肌内注射：异常毒性、过敏反应物质等检查项。原料和工艺易污染热原且用量较大者应考虑设热原检查项注射液为静脉注射必需设异常毒性、热原(细菌内毒素)、过敏反应物质检查、降压反应物质检查、溶血与凝聚检查等所有安全性检查项多组分生化药注射剂基本技术要求:由于原材料为生物来源，成品中含有各种生化物质，为保证注射给药的安全，一般须进行过敏物质、降压物质、异常毒性等检查药典会：生化药品注射剂标准提高专项工作生化药名考虑增订的项目巴曲酶注射液注射用、亮菌甲素注射液内毒素、考查有关物质细菌内毒素或热原、异常毒性薄芝糖肽注射液高分子物质或过敏试验蜂毒注射液蜂毒毒性试验、过敏试验聚肌胞注射液分子量分布、热原灵孢多糖注射液热原、异常毒性、过敏试验灭菌前列腺素E2溶液过敏试验、热原脱氧核苷酸钠注射液异常毒性、考查高分子物质垂体后叶注射液内毒素、异常毒性、过敏试验、有关物质垂体前叶肾上腺皮质提取物注射液过敏试验生化药名考虑增订的项目注射用、亮菌甲素注射液细菌内毒素或热原、异常毒性中性胰岛素注射液精蛋白重组人胰岛素注射液过敏试验、异常毒性过敏试验、异常毒性精蛋白锌胰岛素注射液过敏试验、异常毒性、考查有关物质羟乙基淀粉20氯化钠注射液热原改为细菌内毒素。人参多糖注射液分子量与分子量分布、溶血与凝聚、过敏试验、有关物质、内毒素胎盘多肽注射液