分子克隆工具酶及其应用

分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第一节限制性内切核酸酶一.限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶HindII的发现H．O．Smith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。二.限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。三.限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)四．限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG六.限制酶的星反应（staractivity）1.特点:限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。七.其它特异性的内切酶及其用途1.λ末端酶（λterminase）：5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出现的频率约412分子量为117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（I-SceI）：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418=6.9X1010bp，其识别顺序为5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’TATT3.I-PpoI：来自于Physarumpolycephalum识别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途遗传标记，构建载体八.限制酶的用途1.DNA重组2.限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47—108kD。第二节DNA甲基化酶一.甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M．HpaICmCGGHpaICCGG相同2.E．coli的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。damGmATC，dcmCmCA/TGG3.哺乳动物的甲基化酶该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。4.E．coli中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm和dam甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG)边界重叠ClaI--dam；Sau96I--dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm--BstNI表2对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶识别序列*甲基化酶AvaⅡGG(A/T)CC(A/T)GGdcmBclⅠTGATCAdamClaⅠGATCGATdamEcoRⅡCC(A/T)GGdcmHphⅠGGTGATCdamMboⅠGATCdamNruⅠGATCGCGAdamSau96ⅠGGNCC(A/T)GGdcmSauFⅠCC(A/T)GGdcmStuⅠAGGCCTGGdcmTagⅠGATCGAdamXbaⅠTCTAGATCdam*下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响１）抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)２）抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）３）抑制不同种限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途１）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成２）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切表3甲基化酶与识别序列甲基化酶识别序列a受甲基化影响的限制酶bM.AluⅠAGmCTAluⅠ,BamHⅡ,Bsp1286DdeⅠ,HgiAⅠ,NheⅠ,PstⅠM.BamHⅠGGATmCCBamHⅠ,MspⅠM.ClaⅠATCGmATClaⅠ,MboⅠ,TaqⅠdamGmATCcdcmCCA/TGGcM.EcoRⅠGAmATTCEcoRⅠM.HIdGCNGCGGmCCMstⅠ,PstⅠ,PvuⅡM.HaeⅢGGmCCBanⅡ,BglⅠ,Bsp1286,BstXⅠ,HaeⅢ,MspⅠ,NaeⅠ,NcoⅠ,SacⅡ,Sau96ⅠM.HhaⅠGmCGCAhaⅡ,FnuDⅡ,HhaⅠM.HpaⅡCmCGGAhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠM.HphⅠTmCACCHinfⅠ,HphⅠ,Sau3AⅠM.MspⅠmCCGGBamHⅠ,MspⅠM.PstⅠCTGCmAGAluⅠ,PstⅠM.TaqⅠTCGmAAluI,AvaⅠ,EcoRV,HinCⅡ,HinfⅠ,MboⅠ,TaqⅠ,XmnⅠa.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化;b.所列出的限制酶均已商品化;c.参见表2;d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE第三节核酸酶ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'一.外切酶III（ExoIII）1.一般特点：来自于E.coli，分子量28,000kD2.催化反应类型1)外切酶活性：3’5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.53.外切酶活性特点1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解4.用途1)核酸（DNA）标记2)基因突变----缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加