生物制药

第七章生物技术、生物工程与生物制药第一节生物学简介第二节现代生物工程第三节生物药物2现代生物工程简介一、基因工程二、酶工程三、细胞工程四、发酵工程31.基因工程的诞生20世纪70年代中期，两项关键技术的问世，使得基因工程成功诞生：DNA分子的体外切割与连接技术DNA分子的核酸序列分析技术42.基因工程的定义和研究内容⑴定义：基因工程（Geneengineering）是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能稳定地繁殖，并通过工程化为人类提供有用的产品和服务的技术。52.基因工程的定义和研究内容除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术(DNARecombination)。DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为基因克隆(Genecloning)或分子克隆(Molecularcloning)。62.基因工程的定义和研究内容⑵步骤：切从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。72.基因工程的定义和研究内容⑵步骤：接用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子。82.基因工程的定义和研究内容⑵步骤：转借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。92.基因工程的定义和研究内容⑵步骤：增短时间培养转化后细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。102.基因工程的定义和研究内容⑵步骤：检筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞。113.基因操作的工具和技术⑴工具酶①核酸内切限制酶1978NobelPrize123.基因操作的工具和技术⑴工具酶①核酸内切限制酶——“分子剪刀”133.基因操作的工具和技术⑴工具酶①核酸内切限制酶——“分子剪刀”143.基因操作的工具和技术⑴工具酶②DNA连接酶T4ligase：1967153.基因操作的工具和技术⑵基因克隆载体①质粒载体②噬菌体载体③柯斯质粒载体163.基因操作的工具和技术⑶DNA的提取①物理分离法平衡等密度离心法凝胶电泳分离DNA印迹（Southernblotting）173.基因操作的工具和技术⑶DNA的提取②基因组文库和cDNA文库分离目的基因183.基因操作的工具和技术⑶DNA的提取③PCR变性(90~95℃)复性(37~60℃)延伸(70~75℃)193.基因操作的工具和技术⑷目的基因和载体的连接DNA连接酶203.基因操作的工具和技术⑸重组DNA向宿主细胞的转移、鉴别和表达①目的基因导入受体细胞合适的受体细胞合适的克隆载体合适的基因转移方法转化、转导、杂交细胞融合、显微注射21humanArabidopsis拟南芥ThermotogamaritimaEscherichiacoliBuchnerasp.APSRickettsiaprowazekiiUreaplasmaurealyticumBacillussubtilisDrosophilamelanogasterThermoplasmaacidophilumPlasmodiumfalciparumHelicobacterpylorimouseCaenorhabitiselegansratBorreliaburgorferiBorreliaburgorferiAquifexaeolicusNeisseriameningitidisZ2491Mycobacteriumtuberculosis223.基因操作的工具和技术②阳性克隆的筛选和鉴定遗传检测法双酶切片断重组法报告基因法233.基因操作的工具和技术③克隆的进一步鉴定限制性内切酶分析法分子杂交法PCR法DNA测序法目的基因转录产物检测——Northernblotting目的基因翻译产物检测——Westernblotting243.基因操作的工具和技术④目的基因在受体细胞中的表达254.基因工程药物多肽蛋白质酶激素疫苗单克隆抗体细胞因子定义：又称生物技术药物，是利用重组DNA技术生产的——rhIFN、rhIL、rhCSF、bFGF、EGFInsulin、GH、EPO、胰高血糖素、降钙素rSK、rSAK、rUK、SOD血清白蛋白水蛭素流感、疟疾、艾滋病、狂犬病、结核病狂犬病毒、抗肝癌、胃癌、白血病264.基因工程药物基因工程药物的优势产率274.基因工程药物基因工程药物的优势经济效益生物技术产品的销售额年份美国（亿美元）中国（亿人民币）19862.619886.55199249.219971302000500200284.基因工程药物胰岛素1977年，首次将人胰岛素基因通过大肠杆菌表达成为人胰岛素，基因工程学诞生。294.基因工程药物人体生长激素30314.基因工程药物干扰素抗病毒（流感病毒、HBV、HIV等），防治癌症罗荛愫（IFNα-2a）（IFNα-1b）（IFNα-2b）324.基因工程药物(疫苗)334.基因工程药物(疫苗)341.酶工程概述(1)酶的认识过程(2)酶工程发展概况352.酶工程的内容(1)酶的来源化学合成法提取法发酵法(2)酶的生产菌对菌种的要求生产菌的来源常用的产酶菌362.酶工程的内容(3)酶的分离纯化细胞破碎酶的提取离心分离过滤与膜分离浓缩和干燥酶的纯度与酶活力测定372.酶工程的内容(4)酶分子的改造酶分子修饰生物酶工程(5)酶与细胞固定化38细胞工程细胞工程（cellengineering）应用细胞生物学和分子生物学的方法，在体外条件下进行细胞的培养、繁殖，或人为地改变细胞的生物学特性，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用物质的过程。391.细胞工程的基本内容(1)细胞工程的操作对象原核细胞细菌、放线菌真核细胞酵母菌、动物细胞、植物细胞401.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作①无菌操作杀菌和消毒物理法化学试剂抗生素超净工作台411.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作②细胞培养技术培养基培养板/瓶/皿培养箱421.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作②细胞培养技术431.细胞工程的基本内容(2)细胞工程的基本操作③细胞融合技术制备原生质体诱导细胞融合化学法物理法生物法筛选杂合细胞442.植物细胞工程(1)植物组织培养1920年，德国著名植物学家Haberlandt首次提出“植物细胞全能性”的概念，并用叶肉细胞进行离体培养。由于取材及技术上的原因，并未成功。452.植物细胞工程(1)植物组织培养1934年，美国人White用番茄根为材料，建立了第一个能无限生长的植物组织。462.植物细胞工程(1)植物组织培养1951年，Skoog等人进行腺嘌呤诱导离体烟草茎段上根、芽等器官的形成，获得成功。1958年，美国Steward等和德国Reinert等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，并形成新植株，用实验证明了植物细胞的全能性。472.植物细胞工程(2)植物细胞融合去细胞壁机械法酶法：真菌纤维素酶原生质体融合（细胞杂交）物理法：离心、振动、电刺激化学法：PEG482.植物细胞工程(3)转基因植物技术492.植物细胞工程(3)转基因植物技术①生物药品药用蛋白：疫苗、抗体、细胞因子等优点：产量高、成本低、可作食品直接服用502.植物细胞工程(3)转基因植物技术②转基因食品1994年5月18日，美国FDA正式批准了第一种转基因食品——西红柿上市。512.植物细胞工程(3)转基因植物技术②转基因食品522.植物细胞工程(3)转基因植物技术②转基因食品532.植物细胞工程(3)转基因植物技术③工业用酶消化酶乙醇分解酶α-淀粉酶542.植物细胞工程(3)转基因植物技术④转基因农作物（GMC）1996～2001年全球GMC种植面积增加了30倍。2001年，全球GMC的种植面积达4420万公顷：大豆46%，棉花20%，油菜11%，玉米7%。我国GMC种植面积在13个国家中居第四位，其中，国产转基因抗虫棉在2001年就种植了60万公顷，可以减少农药使用量70%～80%。552.植物细胞工程(3)转基因植物技术④转基因农作物（GMC）第一代GMC：抗虫、抗病、抗除草剂等；第二代GMC：改良作物品质，如“金稻米”。562.植物细胞工程(4)植物次生代谢物的生产紫草素573.动物细胞工程(1)动物细胞/组织培养动物细胞培养原代培养和继代培养贴壁培养和悬浮培养干细胞和定向分化动物组织培养组织工程和人工器官583.动物细胞工程(2)动物细胞融合1958年，冈田善雄用灭活的仙台病毒诱导艾氏腹水瘤细胞融合化学诱导融合电刺激诱导融合593.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体抗原抗体抗原决定簇抗原决定簇603.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体MCAb613.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体德国的柯勒(G.Köhler，1946~)阿根廷的米尔斯坦(C.Milstein，1926~)623.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体633.动物细胞工程(3)淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体疾病诊断检测疾病相关抗原放射性核素标记肿瘤显像疾病治疗针对T细胞抗原的MCAb→免疫抑制剂药物连接MCAb→“生物导弹”643.动物细胞工程(4)细胞拆合①细胞核移植胚胎细胞核移植1981，Illmenses克隆小鼠653.动物细胞工程(4)细胞拆合①细胞核移植体细胞克隆：“多莉”1996.7.5出生1997.2.27《Nature》663.动物细胞工程1998年2月，英国PPL医疗公司克隆牛，名为“杰弗逊”；1998年7月，日本的若山昭彦等人成功地用克隆小鼠进行了克隆试验；2001年1月，美国克隆恒河猴成功，名为“泰特拉”；673.动物细胞工程2001年3月，PPL医疗公司克隆猪成功；2002年1月，中科院研究所陈大元研究员领导的研究小组获得国内第一头克隆牛；2002年3月，美国成功克隆猫；2002年4月，中国的李宁教授领导的研究小组克隆红系冀南牛“波娃”。683.动物细胞工程②染色体移植(4)细胞拆合694.转基因动物2000年，法国科学家利用转基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。704.转基因动物美国弗吉尼亚技术制药工程研究院培育转基因猪，其体内含有人类的基因，产乳后其乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。转基因牛Herman及她的后代，可生产人乳铁传递蛋白）。71发酵工程发酵利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。发酵工程（fermentationengineering）利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。72发酵工程青霉素（penicillin）1929年AlexanderFleming731.发酵工程的内容(1)发酵工程的主要内容生产菌种的选育发酵条件的优化反应器的设计产物的分离、提取与精制741.发酵工程的内容(2)发酵工程的类型微生物菌体发酵微生物酶发酵微生物代谢产物发酵微生物转化发酵生物工程细胞发酵752.发酵工程的特点(1)发酵过程以生物体的自动调节方式进行；(2)反应条件温和，能耗少，设备简单；(3)原料来源广泛，绿色环保；(4)易生产复杂的高分子化合物，选择性强；(5)需要防止杂菌污染，灭菌要求高。763.发酵工程的应用(1)合成化工原料溶剂、润滑剂、软化剂等有机酸(2)冶金工业重金属的浸提(3)酿造工业酒类、酱油等肺炎克氏杆菌对镉的吸附773.发酵工程的应用(4)农、牧业生物固氮