如何构建质粒克隆

如何构建质粒克隆周鸿雁2011.06.15目的基因目的载体BaxpCMV-Sport6EcoRⅠBglⅡ连接Bax基因至EGFP载体思路加入EcoRⅠ酶切位点加入BglⅡ酶切位点连接↑酶切↑目的基因两侧加入酶切位点MCS多克隆位点BaxpCMV-Sport6缺点：无荧光：GFP、Dsred无标签:Flag、HA、MycpCMVSPORT6MCSGene：BAXMGC:20956,IMAGE:4578562Insertsite：EcoRI,XhoI构建过程★设计引物(增加酶切位点,BglⅡ,EcoRⅠ)•目的基因PCR•双酶切载体(BglⅡ,EcoRⅠ)•琼脂糖凝胶电泳•DNA胶回收(基因,载体)•双酶切目的基因(BglⅡ,EcoRⅠ)•目的基因与载体相连•DH5α转化•鉴定第一步：设计目的基因PCR引物目的：1）通过PCR方法扩增目的基因2）在目的基因片断两端增加酶加位点★酶切位点旁需加入保护碱基设计引物前需解决的问题♣1、选择酶切位点♣2、选择保护碱基♣3、终止密码子PEGFPMCS选择酶切插入位点：1、两个酶切位点间隔远2、目的基因序列中无相应酶切位点3、酶切缓冲液一致▲▲▲▲▲BAXinsertsequence•atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt•gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaenzymeBAXbufferSalⅠ0XhoⅠ12,3,4EcoRⅠ01,2,3,4BamHⅠ1BglⅡ03PstⅠ0BclⅠ0**DNAStar软件-MapDraw功能AGATCT----BglⅡbuffer3GAATTC----EcoRIbuffer3AGATCT目的基因CTTAAGAGATCT---目的基因---CTTAAGPCR产物产物酶切效率低、不准确！！酶切位点保护碱基protectionseqence:GGAAGATCTTCC2h=25%,20h90%CCGGAATTCCGG2h90%,20h90%切割率提高酶切活性、增加酶切效率、缩短酶切时间保护碱基:限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响设计引物原则1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，引物序列的GC含量一般为40-60%2.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳3.避免引物二聚体及发夹结构4.引物的特异性5.碱基随机分布•cggcggtgatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggccPrimer1ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG(length---21,GC%---71.8%,Tm---71.4)•ggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaggcccccagPrimer2TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG(length---25,GC%---52%,Tm---68.4)设计引物Primer5软件引物中是否应包含终止密码子？MCS在EGFP之后表达，需加终止密码子MCS在DsRed之前表达，不可以加终止密码子加入保护碱基及酶切位点•Primer1•GGAAGATCT•ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG•Primer2•CCGGAATTC•TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG★MCS与荧光相连的地方应特别注意有无移码调整开放阅读框（ORF）荧光表达在前时(EGFP)•Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG•Primer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG•因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理会荧光表达在后时(DsRed)•Primer1CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc•Primer2CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg荧光表达在后时需加KOZAK序列•Primer1CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc•Primer2CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg•KOZAK序列:gccacc,加在起始密码子之前Primerfinal•Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG•Primer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG33.5uLdH2O10uLphusionHFbuffer1uLdNTP(10mM)2.5uLprimerforward/reward1uLBAX1.5ulDMSO0.5uLphusionpolymerase50uL1.98℃(1min)2.98℃(5s)3.65℃(20s)4.72℃(20s)5.backtostep2for25times6.72℃(10min)7.18℃forever第二步：PCR目的基因Phusion超保真PCR试剂盒Buffer3:2ulvector:4ul100%BSA:0.2ulEcoRⅠ:1ulBglⅡ:2ulddH2O:10.8ul37℃4hEcoRⅠBglⅡ第三步：双酶切载体20ul第四步：琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收•0.6%gel•6*loadingbuffer•50ulsample•80V目的基因5kb2.5kb载体琼脂糖浓度%DNA分离范围0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～3Buffer3:2ulBAX:15ul100%BSA:0.2ulEcoRⅠ:0.5ulBglⅡ:1ulddH2O:1.3ul37℃4h第五步：双酶切及回收目的基因20ulTAKARA片断回收试剂盒第六步：回收效率验证5kb2.5kbLoadingvolume:5ulFromlefttoright:Marker:15000bpEGFPBAXrestrictionBAXPCRMarker:100bpT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:3ulvector:1ulddH2O:13ulT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:6ulvector:1ulddH2O:10ulT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:10ulvector:1ulddH2O:6ul(1)(2)(3)16℃过夜第六步：连接载体100ng:100x目的基因分子量载体分子量X4/1~10/1目的基因的量为:第七步：转化•100ulDH5α+20ul连接产物第八步：验证(1)•PCR1-1213-24Positive:2,7,9,105.4uLdH2O2uLphusionHFbuffer0.2uLdNTP(10mM)0.5uLprimerforward0.5uLprimerreward1uL菌液稀释液0.3ulDMSO0.1uLphusionpolymerase10uL第八步：验证(2)•双酶切(EcoRⅠ,BglⅡ)Positive:2,7,9,10Loadingvolume:10ulBuffer3:2ultemplate:5ul100%BSA:0.2ulEcoRⅠ:0.5ulBglⅡ:1ulddH2O:11.3ul20ul37℃3h第八步：验证(3)谢谢，敬请批评指正！克隆连接平端连接难连接粘端连接易连接