侦测食品中之微生物

DetectingMOinFoodsAims1.Tounderstandthetraditionalmethodsandrapidmethodsfordetectingmicroorganismsinfoods2.Tounderstandtheprinciples,advantages,limits,andapplicationforeachdetectingmethod3.Tounderstandtheissuesofthemetabolicallyinjuredmicroorganisms(MO)andtheviablebutnon-cultivableMO(VBNC)Outline1.Homogenizationmethods2.Standardplatecount(SPC)3.Spiralplatecount4.Membranefiltrationmethods5.Microscopeplatecount6.Petrifilm7.MPN8.Directmicroscopiccount9.Dyereductiontest10.DetectingMOonsurfaces11.Metabolicallyinjuredmicroorganisms12.Viablebutnon-cultivablemicroorganisms(VBNC)13.Phisical,chemical,molecular,andimmunologicalmethods§均質法（Homogenizationmethods）WaringBlendorvs.StomacherWaringBlendor為廣泛使用方法(除了有刺、尖銳之食品外)，優點：1.免於清洗、殺菌操作2.正常操作時間內（≦2min）不生熱，不影響菌數3.噪音低4.均質液易貯藏5.不會引起食品組織（細胞）之高度破碎，容易吸取樣品，而且，降低來自食品組成份之干擾（尤其在非SPC偵測法）9-1§標準平板法〔StandardPlateCount(SPC)〕，活菌數1.計數：25~250cfu（或30~300cfu）2.假設：(1)各培養皿中之菌落源自單一菌體。(2)所提供之條件（營養、溫度等）足以使食物中所有菌生長，而產生菌落。3.方法：(1)混稀法（pourplatecount）(2)塗抹法（spreadplatecount,surfaceplatecount）塗抹法優缺點（與混稀法比較）(a)無熱傷害(b)有利好氧菌快速生長(c)容易計數(d)可自動化操作(e)菌落易分離§螺旋平板法（Spiralplatecount）1.所用培養基、平板、稀釋液、吸管均較少2.快速，50~60plate/h3.易受食物顆粒阻塞5.設備費用高9-2§膜濾法（Membranefiltrationmethods）適用於水、飲料、或空氣等菌數低者可能需預濾，以去除食物顆粒，或添加酵素、介面活性劑等以利過濾1.直接螢光過濾法（DirectEpifluorescentFilterTechnique，DEFT）留於濾膜上之菌株，以螢光染劑，如acridineorange染色，再以螢光顯微鏡計數操作：Foodhomogenate↓5μmnylonfilter↓filtrate,＋2mlTritonX-100&0.5mlTrypsin↓0.6μmNucleoporepolycarbonatefilter↓filterstainedwithacrineorange↓count2.Microcolony-DEFTMicrocolonymethod：Sample→filter→plate,incubatefor3~6h→microscopiccountMicrocolony-DEFTmethod：Sample→filter→plate,andincubated→acridineorangestain→fluorescencemicroscopiccount9-3Filtration(nucleoporemembrane)3.疏水性格膜過濾法（HydrophobicGridMembraneFiltration,HGMF）(1)1600waxgrid/membrane(2)減少稀釋操作(3)已有分析項目totalcoliformsfecalcoliformsSalmonellaeE.coliO157:H7§顯微鏡菌落計數（Microscopecolonycounts）0.1mlsample＋2mlnutrientagar→mix→spreadovera4cm2areaonaglassslide→incubated3~8hinawarmmoistchamber→airdried,flame-fixed,stainforcountwithmicroscope.§Petrifilm1.將培養基塗敷於數層纖維所構成之薄膜上2.攜帶儲存方便3.可用於表面微生物分析§最可能菌數法〔MostProbableNumber（MPN）〕，活菌數1.3-tubeor5-tube2.atleast3seriousdilutionsareused3.monitoredbyturbidity,colorchange,orgasproduction4.estimateddata,lessprecisethanagarplatingmethods5.usedforlowcellcounts9-4§染劑還原法（DyeReductionTests），活菌數1.原理：菌體具reductase，當菌體代謝時，故使培養液還原所需時間與菌數成反比。2.還原指示劑：methyleneblue：從藍色變成無色resazurin：二段式，(1)從藍→紫→粉紅，不因O2存在而又變成藍；(2)從粉紅變無色，可因O2存在又氧化成粉紅。3.特性(1)比SPC快(2)估測值(3)非所有MO.還原能力（速度）相同(4)指示劑可能對部分MO.有抑制作用(5)食品本身可能亦含還原劑或酵素而干擾§直接鏡檢〔DirectMicroscopicCounts（DMC）〕，活、死菌1.操作(1)取0.01ml均質液平均塗抹於1cm2面積之載玻片上(2)固定（40-50℃）、乾燥(3)染色(4)油鏡下計數2.優點(1)快速；(2)簡單；(3)不需其他設備；(4)觀看菌體形狀；(5)樣品量極少。9-53.缺點(1)死、活不分；(2)僅適用於高菌含量樣品；(3)觀察者易疲勞；(4)菌體可能成團，分散不均，或有些不易染色。現已有方法區分死、活菌體HowardMoldCount1911年由B.J.Howard開發，分析蕃茄製品中黴菌，另外，機械黴Geotrichumcandidum亦相似，均利用有凹槽載玻片，在顯微鏡下，計數食品中所含黴菌菌絲，需有經驗者方能操作，且易疲勞。§表面微生物檢驗生物體表加工機械、器皿、工作台1.Swab/Swab-RinseMethod最早、最廣泛使用者以棉花棒（濕）塗抹固定面積之物體表面，再將之放入含無菌水之試管內，均質，稀釋，平板法計數，若配合ATP分析法，塗抹後，可迅速得知結果，常用於清洗效果之評估用。9-62.接觸平板法（Contactplate）以特殊雙重皿，導入15.5-16.5ml之培養基，產生凸起洋菜培養基表面，將之覆蓋於欲測物面，加蓋培養，計數菌落數。回收率不高，有人云僅0.1％，即若測得10cfu/cm2，實際含量為104cfu/cm2。亦有人實驗顯示回收率低於塗抹法（Swabmethod），較適用於低污染物表面。3.噴槍法（Spraygun）以高壓水沖洗物體表面，再分析洗液中菌數。對肉品表面菌數分析，此法優於塗抹法。§代謝性受傷之微生物（Metabolicallyinjuredorganisms）微生物受次死環境侵害，影響其代謝（但未死亡），故在選擇性培養基上無法生長，但可在非選擇性培養基生長，故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養基分析之，二者之差，即為InjuredMO.。食品病原菌之檢測管制，常為「不得檢出」，測試樣品由於曾經凍藏、或加熱等處理，可能含有受傷之病原菌（未死），故通常需將樣品均質液放在適當非選擇性培養液中短暫時間（1~4h），使受傷菌復原，再以選擇性培養基分析之。原，此二物質之功能均為分解過氧化物，故推測受傷菌可能缺乏去除過氧化物之能力。MO.代謝性傷害可能發生在細胞膜（脂質）、核醣體、DNA、或某些酵素。9-7§不能培養的活菌（Viablebutnon-cultivableorganisms,VBNC）VBNC與代謝傷害性菌不同，後者可於非選擇性培養基修護。VBNC首被發現於海洋弧菌，當海水溫度被降至5℃，弧菌成為VBNC狀態。此時，platecount者很低，但由以acridineorange之鏡檢法（可區分死、活），菌數卻非常高。當溫度升高，VBNC即可恢復原來狀態，處於VBNC之病菌，仍具致病力，僅毒性較低。9-8§物理、化學、分子及免疫分析法A.物理方法1.電阻抗或導電度法（Impedance/ConductanceMethod）(1)原理：微生物生長時，要利用（分解）環境中成份，因此改變環境（培養液）中電阻抗/導電度。(2)固定儀器，有其偵測之靈敏度。(3)儀器感應出電阻抗/導電度變化所需時間（Detectiontime）與菌體數成反比。(4)由已知菌數樣品進行標準曲線之制訂，再用以分析未知菌數。(5)Vitek公司之Bactometer測電阻抗；Malthus公司則偵測導電度。2.流電細胞計數法（flowcytometry）原用魚動物細胞測定，現可用於酵母菌計數，若配合螢光抗體，可測特定細菌。B.化學方法1.Thermostablenuclease(1)金黃葡萄球菌具coagulase及therostablenuclease，二者相關性高，故藉由食品中Thermostablenuclease活性高低，得知S.aureus多少。然部分enterococcus亦具nuclease活性，且少部分為thernostablenuclease（4.3％）。9-9(2)分析thermostablenuclease以代表S.aureus生長狀況之優點：(a)耐熱性，即使菌體因熱死亡，nuclease仍在，而S.aureus所產之腸毒素亦屬熱安定性。(b)偵測比腸毒素快。(c)比腸毒素早產生。(d)不需濃縮即可偵測，腸毒素需濃縮。(e)二者均為熱安定性。2.LimuluslysateforendotoxinsG(－)之outermembrane之lipopolysaccharide（LPS）—endotoxinLimuluspolyphemous之amoebocyte（血球細胞）裂解物蛋白對endotoxin極敏感（活化），使得lysate呈膠狀，早期分析法乃偵測可使lysate成gel之最大食品稀釋度（即為力價數，titer），為半定量法。近來，發展出呈色法，加入試劑（如gly(ala)-arg-ρ-nitroalanine（ρNA），當樣品中有LPS，可使coagulase活化，其可將ρNA水解，產生ρ-nitroalanine，測405nm吸光值。EndotoxinFactorCFactorC*FactorBFactorB*ProclottingenzymeClottingenzyme*：活化狀態CoagulogenCoagulin9-10(coagulase)(coagulase*)ρNA:ρ-nitroalanine3.ATP測定活細胞均有ATP且細胞內ATP含量恆定，以菌量而言，含量約10－18~10－17mole/cell，將菌體內之ATP萃取出來，分析其ATP含量，即間接代表菌數多寡。利用螢火蟲發光機制，來分析ATP：LH2＋E＋ATPE·LH2－AMP＋PPiE·LH2－AMP＋O2E＋L＝O＋CO2＋AMP＋LightLH2：luciferinE：luciferaseL＝O：oxyluciferinPPi：pyr