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生物技术制药第六章植物细胞制药第六章植物细胞制药第一节概述第二节植物细胞的形态和生理特性第三节植物细胞培养的基本技术第四节影响植物次级代谢产物累积的因素第五节植物细胞培养的生物反应器第六节进展与展望第一节概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分。一、基本概念1、植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。植物无菌培养技术分如下几类：①幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（plantculture）；②从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养”（callusculture）；③能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”（suspensionculture）；④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养”（organculture）；⑤未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培养”（embryoculture）。1、植物组织和细胞培养2、悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。3、细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。4、分生组织培养分生组织培养（meristemculture）又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括1~2个叶原基。5、外植体外植体（explant）是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成器官形成（organogenesis）一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成（embryogenesis）。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体”（embryoid，orembryo-like）或“不定胚”（adventitiousembryo）。7、无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”（clonalvariant）。8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体（mutant）。由单细胞形成的无性系称为“单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单细胞变异体”。9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”（subculture），又称“连续培养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。10、次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：①有明显的分类学区域界限；②其合成需在一定的条件下才能发生；③缺乏明确的生理功能；④是生命的多余成分。现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。二、植物细胞培养的发展简史19世纪上半页，Schleiden和Schwann提出了细胞学说；20世纪初，德国著名植物学家Haberlandt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；20世纪20年代初至30年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。Hanning首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。第二节植物细胞的形态和生理特性一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细胞则多呈管状。植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，种子植物薄壁细胞的直径在20~100微米之间；储藏组织细胞的直径可达1mm。苎麻纤维一般为200mm，有的可达500mm以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十米不等。二、植物细胞的结构特征根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞（prokaryoticcell）和真核细胞（eukaryoticcell）。真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细胞中只有类核（nucleoid）。类核没有核膜包被，常常只有一条DNA，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有3个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）见书中图。三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程中的产物。一类是后含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（saccharide）、盐类（salts）、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。三、细胞后含物和生理活性物质1、细胞后含物（1）生物碱生物碱（alkaloide）是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。1、细胞后含物（2）糖苷类糖苷（glucosides）是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。1、细胞后含物（3）挥发油挥发油（volatileoil）是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油等。1、细胞后含物（4）有机酸有机酸（organicacids）是糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。2、生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。（1）酶类酶（enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。2、生理活性物质（2）维生素维生素（vitamin）是一类复杂的有机物，常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素B12处理后可促进不定根的生长。2、生理活性物质（3）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，其量虽微，但作用甚大。2、生理活性物质（4）抗生素和植物杀菌素抗生素（antibiotic）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（plantfungicidin）。四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。延迟期（lagphase）细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和[培养基性质，其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高RNA含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分四、植物培养细胞的生理特性加速期（accelerationphase）细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA浓度和蛋白质累积率，持续时间3~4代，其特征为常数：干重增加：细胞数、DNA和蛋白质浓度减少：有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力增加细胞鲜种、干重及RNA酶活性四、植物培养细胞的生理特性对数期（logphase）介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间，其特征为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少稳定期（stationaryphase）细胞数稳定，其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。四、植物培养细胞的生理特性由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在2~200之间，直径为2mm左右。四、植物培养细胞的生理特性细胞团产生的原因有两个：（1）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（2）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间的延长，细胞数量呈指数上升。四、植物培养细胞的生理特性所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要很高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的pH为5~7，在此pH水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。四、植物培养细胞的生理特性植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞培养时那么严重，泡沫的性质也不同。气泡比微生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，这就造成了非均相培养，通常需要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受到影响。四、植