生物技术制药

1生物技术制药第一章绪论生物技术所含技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等，基因工程是生物技术的核心和关键，细胞工程是生物技术的基础，酶工程是生物技术的条件，发酵工程是生物技术获得终产品的手段。（他们在生物制药过程中的相互关系自己展开)第二章基因工程制药1.基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体，拼接，转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。2.基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)下游阶段：从工程菌的大量培养直到产品的分离纯化和质量控制3.制备基因工程药物的一般程序目的基因的获得→重组质粒的构建→工程菌的构建→工程菌的培养→产品的分离纯化→过滤（除菌）半成品检验和鉴定→成品检验和鉴定→产品包装、出产4.目的基因的获取途径：a.逆转录法：分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。真核细胞mRNA有3’-polyAb.反转录-聚合酶链反应法（原理，过程，步骤，药物等自己展开）c.化学合成法5.宿主细胞的分类：①原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。原核细胞：①大肠杆菌特点:A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusionbody)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复姓处理才能恢复其生物活性。C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。②枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。③链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。真核细胞①酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。②丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。6.大肠杆菌中的基因表达（表达载体:Pbv220系统与PET系统区别）2a.表达载体必须具备的条件:①载体能够独立的复制；②具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；③具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；④具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；⑤具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。⑥所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。实例：pBV220系统，中国预防医学科学院病毒学研究所构建。已成功的用于表达IL-2/3/4/6/8、TFNα、TNFγ、TNF、G-CSF、GM-CSF等细胞因子。三类主要基因工程表达体系的比较7.质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见)结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。8.基因工程菌的培养方式a.分批培养：为了保持基因工程菌生长所需要的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制与流加补料结合起来进行，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。b、补料分批培养：将种子接入发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。。c、连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。d、透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去处培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。f、固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种。9.细胞破碎的方法：①物理法（匀浆法，珠磨法，超声法）②化学法(渗透冲击，增溶法)，生物法（酶溶法）10.基因工程药物分离纯化步骤：细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高度纯化直至得到成品，成品加工。11.色谱技术分为离子交换色谱，疏水色谱，亲和色谱，凝胶过滤色谱，反相色谱，高压液相色谱（前四种的原理，特点，优缺点自己展开）①离子交换层析（IEC）基本原理：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。②疏水色谱（HIC）基本原理：主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。③亲和层析（AC）基本原理：是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。④凝胶过滤基本原理：是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。12.生物材料的质量控制主要是目的基因，表达载体，宿主细胞的检查。13.产品保存a、液态保存①低温保存：液态蛋白质样品在-10~-20°C以下冰冻保存。3②在稳定pH条件下保存③高浓度保存④加保护剂保存b.固态保存（比液态稳定）第三章动物细胞工程制药1.动物细胞形态：贴壁细胞，悬浮细胞，兼性贴壁细胞。动物细胞的生理特点2.动物细胞的生理特点：a.细胞的分裂周期长（G1期，S期，G2期，M期）b.细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。c.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的(可培养50代)d.动物细胞对周围环境十分敏感e.动物细胞对培养基的要求高f.动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同3.当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即细胞与周围细胞接触时，细胞就停止增殖—接触抑制。4.原代细胞:直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液5.二倍体细胞系:原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株6.转化细胞系:通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力7.融合细胞系:两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。融合方法（诱导物）：仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法8.Namalwa从淋巴瘤病人分离，生产干扰素Vero从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细胞，用于制备疫苗9.维持细胞培养所需的最佳条件①动物细胞最适合的pH值为7.2～7.4②最理想的渗透压是：290～300mOsm/kg,③哺乳动物细胞的最佳培养温度为：(37±5)℃,昆虫细胞：27℃,④细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中组织中的氧分压：0.7～4kPa，即5～70mmHg10.动物细胞培养基的种类:①天然培养基②合成培养基③无血清培养基11.添加(5%-10%)小牛血清的作用：①提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；②提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；③提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素12.细胞消化分离法中常用消化物是胰酶蛋白，乙二胺四乙酸，胰酶-柠檬酸盐等13．细胞计数①自动细胞计数器②血球计数板计数→区别死活（台盼蓝（死细胞呈蓝色）苯胺黑）结晶紫染色细胞核计数法→MTT染色计数法（原理及方法）原理：活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT（淡黄色）转变为不可溶性的紫色的结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。它可溶于脱色液，其色泽的深浅与活细胞的数量成正比，通过比色即可从标准曲线求出细胞数。MTT溶液的配制方法：通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住14.细胞的冻存的原则慢冻快融保护剂：甘油、DMSO(10%)15.理想微载体具备的条件：①微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸展和增殖②微载体的材料无病毒。不仅要求对细胞的生长无毒性，而且也不会产生影响产品和人体健康的有害因子③微载体的材料是惰性的，不与培养基的成分发生化学反应，也不会吸收培养基中的营养成分4④微载体的比重为1.030～1.045g/ml,使载体在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获。⑤粒径在60～250um(溶胀后)之间为好，并要尽可能均一，差异不大于20um。这样有利于细胞均匀分布在各微载体表面。⑥具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况。⑦基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体互相摩擦而损伤细胞⑧可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌⑨经简单的适当处理后，可反复使用⑩原料充分，制作简便，价廉该法的优点是它既可创造相当大的帖附面积供细胞帖附生长增殖，满足了绝大多数细胞的基本要求，又由于载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基上，充分发挥了悬浮培养的一切优点。16.动物细胞培养用生物反应器：搅拌罐生物反应器，气升式生物反应器，中空纤维管生物反应器，固定床或流化床生物反应器，透析袋或膜式生物反应器17.动物细胞产品常用的纯化方法：a.离心b.离子交换层析常用离子交换剂：离子交换葡聚糖凝胶（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex、CM-Sephadex和SP-Sephadex等）离子交换纤维素c.凝胶过滤具备的条件:惰性载体,化学性质稳定,尽可能是低电荷,颗粒大小均匀,机械强度高广泛采用的凝胶:交联葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶d.亲和层析f.盐析和有机溶剂沉淀e.透析g.高压液相层析第四章抗体制药1.从两个方面对单克隆抗体加以改造：①降低单克隆抗体的免疫原性②降低单克隆抗体的相对分子量。2.人-鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。3.改形抗体：又称CDR移植抗体，是Ig分子中参与构成抗原部位的区域，是H和L链V区的互补性决定区，而不是整个可变区。小分子抗体：只要将免疫球蛋白切割，则为小分子抗体（Fab与Fv抗体）4.一个B细胞针对一个抗原决定簇所产生的一种特异性抗体，称为单克隆抗体选择培养基为HAT培养基5..单克隆抗体制备的过程及原理（144页）原理：将抗体产生的细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为统一的单克隆细胞系。此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高克隆抗体。过程：①饲养细胞制备：腹腔巨噬细胞②亲本细胞培养：骨髓瘤细胞核免疫脾细胞③细胞融合④杂交瘤细胞的筛选⑤阳性杂交瘤细胞的克隆培养⑥杂交瘤细胞的冻存与复苏⑦McAb的规模化生产单克隆抗体的制备流程：抗原与动物免疫→细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养→筛选阳性克隆与克隆化→杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定→单克隆抗体的大量制备→单克隆抗体的纯化单克隆抗体人源化的改进鼠抗体人源化（人-鼠嵌