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生物技术制药BiotechnologicalPharmaceutics第五课抗体制药抗体制药主要内容免疫学基础知识抗体（免疫球蛋白）的结构单克隆抗体及其制备基因工程抗体的制备抗体诊断试剂和治疗药物要求掌握抗体、基因工程抗体的概念和结构掌握单克隆抗体和基因工程抗体制备的思路和方法抗体制药免疫学基础知识免疫系统（immunesystem）机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统免疫系统的构成免疫组织和器官中枢免疫组织和器官外周免疫组织和器官免疫细胞固有免疫的组成细胞适应性免疫应答细胞免疫分子与抗原分子免疫球蛋白、补体、细胞因子等抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官骨髓（bonemarrow）人体极为重要的造血器官和免疫器官各类血细胞和免疫细胞发生的场所B细胞、NK细胞分化成熟的场所体液免疫应答发生的场所抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官胸腺（thymus）T细胞分化、发育、成熟的场所。从骨髓迁入的淋巴样祖细胞，在胸腺特定的环境中，经过复杂的分化和发育过程，最终成为功能性CD4+T细胞及CD8+T细胞，输出胸腺，定位于外周淋巴器官和组织。抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官淋巴结（lymphnode）广泛存在于全身非黏膜部位的淋巴通道上，人体全身约有500～600个，一般群集在外源物质容易入侵的部位成熟T细胞和B细胞定居的主要场所，其中T细胞约占淋巴结内细胞总数的75%，B细胞占25%免疫应答发生的场所参与淋巴细胞的再循环淋巴结内的巨噬细胞能吞噬、清除抗原性异物，发挥过滤作用抗体制药免疫组织和器官淋巴结（lymphnode）抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官脾（spleen）T细胞和B细胞定居的场所（B细胞60%，T细胞40%）免疫应答发生的场所合成并分泌某些重要的生物活性物质，如补体成分过滤、清除血液中的异物，净化血液抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官黏膜免疫系统（mucosalimmunesystem）主要存在于呼吸道、肠道及泌尿生殖道等部位人体黏膜表面积约400m2病原微生物等异源物质入侵机体的主要门户，因此，黏膜系统是人体重要的防御屏障机体近50%的淋巴组织存在于黏膜系统，因此黏膜系统又是发生局部特异性免疫应答的主要部位可以产生分泌型IgA抗体制药免疫组织和器官黏膜免疫系统口腔上皮组织呼吸道上皮组织肠表皮组织子宫颈表皮组织抗体制药免疫细胞固有免疫与适应性免疫细胞抗体制药免疫细胞固有免疫（innateimmunity）——生物体与生俱来的防御机制，可对入侵的病原体迅速作出应答，产生非特异抗感染免疫作用固有免疫的组成细胞吞噬细胞（phagocytes）单核吞噬细胞（mononuclearphagocytes）中性粒细胞（neutrophil）树突状细胞（dendriticcell）NK细胞（naturalkillercell）嗜酸性粒细胞（eosinophil）嗜碱性粒细胞（basophil）和肥大细胞（mastcell）抗体制药免疫细胞巨噬细胞（macrophage）巨噬细胞是最重要的一种吞噬细胞，属于单核吞噬细胞类定居型巨噬细胞清除体内衰老损伤或凋亡的细胞，清除抗原性异物游走型巨噬细胞细胞质内含有大量溶酶体，具有强大的吞噬微生物、吞噬清除体内凋亡细胞及其他异物的能力巨噬细胞的主要功能吞噬、清除抗原性异物参与、促进炎症反应加工提呈抗原，启动适应性免疫应答抗体制药免疫细胞巨噬细胞（macrophage）抗体制药免疫细胞自然杀伤细胞（NK细胞，naturalkillercell）来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育和成熟依赖于骨髓和胸腺微环境主要分布于外周血和脾不表达特异性抗原识别受体，但可表达多种表面标志无需抗原预先致敏，可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞NK细胞激活后，可分泌IFN-、IL-2和TNF等细胞因子，发挥免疫调节作用免疫细胞自然杀伤细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用抗体制药抗体制药免疫细胞适应性免疫（adaptiveimmune）——体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程适应性免疫应答细胞T淋巴细胞（Tlymphocyte）B淋巴细胞（Blymphocyte）抗体制药免疫细胞T淋巴细胞（T细胞）来源于骨髓中的淋巴样祖细胞，在胸腺中发育成熟T细胞表面具有许多重要的膜分子，参与T细胞识别抗原，以及T细胞的活化、增殖、分化及效应功能的发挥抗体制药免疫细胞T细胞与HIVT细胞表面的CD4分子是HIV壳膜蛋白gp120受体，与CD4分子结合是HIV入侵并感染CD4+T细胞的重要机制抗体制药免疫细胞B淋巴细胞（B细胞）B细胞产生特异的免疫球蛋白，特异性地与抗原结合B细胞表面有众多膜分子，对B细胞识别抗原，以及激活、增殖、产生抗体、加工提呈抗原给T细胞发挥重要作用抗体制药免疫分子与抗原分子抗原抗体——免疫球蛋白补体系统抗体制药免疫分子抗原（antigen，Ag）能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质特征1：具有免疫原性——抗原进入机体内，能促使机体产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性特征2：具有抗原特异性——能选择性地与某种抗体结合并发生作用完全抗原同时具有免疫原性和抗原特异性的物质不完全抗原或半抗原（hapten）只能与特定的抗体作用但不引起机体免疫应答的简单分子抗体制药免疫分子抗原的异物性异物性是抗原免疫原性的本质抗原与机体之间的亲缘关系越远，组织结构差异越大，异物性就越强，其免疫原性就越强抗原的特异性某一特定抗原只能刺激机体产生特定的抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该抗体或对该抗原应答的淋巴细胞有特异性结合抗原表位（antigenepitope）抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇（antigenicdeterminant）能与抗体分子结合的抗原表位的总数称为抗原结合价天然抗原一般是大分子，含多个表位，是多价抗原抗体制药免疫分子抗原分子的理化性质对抗原免疫原性的影响一般蛋白质是良好的抗原，而脂类和哺乳动物细胞核成分（如DNA、组蛋白等）一般不诱导免疫应答抗原的分子量越大，含有抗原表位越多，结构越复杂，则免疫原性越强（一般大于100kDa的为强抗原）蛋白分子中含有较多的芳香族氨基酸，则免疫原性较强蛋白质的构象及氨基酸所处侧链的位置不同可影响抗原与淋巴细胞中受体的结合，从而影响抗原的免疫原性一般聚合状态的蛋白质较其单体有更强的免疫原性抗体制药免疫分子抗体（antibody，Ab）抗体是机体经抗原刺激，由免疫细胞产生的一组免疫球蛋白具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应功能：防御外界物质对机体的侵袭最常用的抗体是免疫球蛋白G（IgG），它在血清免疫球蛋白中的含量最高，约占70%抗体制药免疫分子补体（complement,C）系统存在于血清、组织液和细胞膜表面的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，包括30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白补体成分均为糖蛋白，多属球蛋白，少数为及球蛋白肝细胞和巨噬细胞是补体的主要生成细胞在生理情况下，血清中大多数补体成分均以无活性的酶前体形式存在。当前一组分被激活，即具备了裂解下一组分的活性，由此形成一系列放大的级联反应抗体制药免疫分子补体的生物学作用参与宿主早期抗感染免疫溶解细胞、细菌和病毒促进吞噬细胞的吞噬作用引起炎症反应维护机体内环境稳定清除免疫复合物和凋亡的细胞参与适应性免疫参与免疫应答的诱导和调节参与免疫细胞的增殖、分化参与免疫记忆抗体制药抗体（免疫球蛋白）的结构免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的类型免疫球蛋白的功能人工抗体抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）可分为分泌型（secretedIg，sIg）和膜型（membraneIg，mIg），前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能，后者构成B细胞膜上的抗原受体免疫球蛋白由四条肽链组成，各肽链间有数量不等的链间二硫键结构上可分为三个长度大致相同的片段，形成一Y字形结构，称为Ig单体，构成免疫球蛋白分子的基本单位抗体制药免疫球蛋白的基本结构抗体制药免疫球蛋白的基本结构重链（heavychain，H）由450～550个氨基酸残基组成，分子量50～75kDa轻链（lightchain，L）由214个氨基酸残基构成，分子量约25kDa轻链有链和链两种，一个天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可存在分别带有链和链的抗体分子，其比例具有种属特异性抗体制药免疫球蛋白的基本结构可变区（variableregion，V区）轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列变化较大的区域重链和轻链的V区分别称为VH和VL分别占重链和轻链的1/4和1/2VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（CDR），共同组成Ig的抗原结合部位在V区中CDR之外的区域氨基酸组成和序列相对不变，称为骨架区（FR）抗体制药免疫球蛋白的基本结构抗体的互补决定区（CDR）与抗原表位结合示意图抗体制药免疫球蛋白的基本结构恒定区（constantregion，C区）靠近C-端氨基酸序列相对稳定的区域重链和轻链的C区分别称为CH和CL分别占重链和轻链的3/4和1/2不同型Ig的CL长度基本一致，但不同类IgCH的长度不一抗体制药免疫球蛋白的基本结构Ig的结构域两条重链和轻链均可折叠成数个球形结构域，每个结构域约由110个氨基酸残基构成二级结构由反向平行的两个-片层（-sheet）组成，两个-片中心的两个Cys由一个链内二硫键垂直连接，形成“-桶状（-barrel）”结构，这种折叠方式称为“免疫球蛋白折叠（immuno-globulinfolding）”抗体制药免疫球蛋白的基本结构铰链区（hingeregion）位于CH1与CH2之间含有丰富的Pro易伸展、弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解片段水解部位是Ig铰链区二硫键连接的两条重链在近N-端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab片段和一个Fc片段Fab片段即抗原结合片段（fragmentantigenbinding），由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成，为单价抗体片段，可与抗体结合，但不凝集Fc片段即可结晶片段（fragmentcry-stallizable），相当于IgG的CH2和CH3结构域，无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶水解片段作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C-端，水解后可获得一个F(ab')2片段和一些小片段pFc'F(ab')2片段由两个Fab及铰链区组成，是双价抗体片段，可同时结合两个抗原表位，可发生凝集反应和沉淀反应F(ab')2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc片段免疫原性可能引起的副作用，广泛用作生物制品抗体制药免疫球蛋白的分类类（class）同一种属的所有个体内，Ig重链C区所含抗原表位不同，据此可将重链分为、、、、链五种，与此对应的Ig分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE亚类（subclass）同一类免疫球蛋白其重链的抗原性及二硫键数目和位置不同，据此可将Ig分为各