园艺植物生物技术第八章

Chapter8MolecularMarkertechnologyanditsapplication分子标记技术及应用§8.1Geneticmarker（遗传标记）Geneticmarker（遗传标记）canbeclearlyreflectthecharacteristicsofgeneticpolymorphisms.(是指可以明确反映遗传多态性的生物特征)Geneticpolymorphisms(遗传多态性):Thevariationofalleleinclassicgenetics.(经典遗传学中，指等位基因的变异。)Therelativedifferencebetweenanysiteinthegenomeinmoderngentics.(现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。)8.1.1Concept8.1.2Geneticmarkerlevels(遗传标记的类型)Morphologicalmarker（形态标记）Cytologicalmarker(细胞学标记)Biochemicalmarker(生化标记)Molecularmarker(分子标记)（1）Morphologicalmarker(形态标记)Referstothosecanclearlyshowthegeneticpolymorphismsoftheappearance.(指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状)Forexample:therelativediferenceofflowercolor,plantheight,fruitshap,andsoon.广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。Advantage：Simpleandintuitive,economicandconvenient(简单直观、经济方便等)。Disadvantage：Quantityislimited,lesspolymorphism.(在多数植物中数量是很有限，多态性较少)；Affectedbyenvirmentanddevelopment.易受环境、生育期等因素的影响；linkagewithbadgenessometims.(有一些标记与不良性状的基因连锁)longerperiod.(周期比较长)。Morphologicalmarker（2）Cytologicalmarkers细胞学标记细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。Structurecharacteristicsofchromosomes(染色体的结构特征)Quantitycharacteristicsofchromosomes(染色体的数量特征)Structurecharacteristicsincludesvariationchromosomekaryotype(核型）andchromosomebandingpattern（C-band、N-band、G-band）.Quantitycharacteristicsincludestheeuploid(整倍体)andaneuploid(非整倍体).Advantage:itcanbeusedtomapsomeimportantgenesonchromosomes(能进行一些重要基因的染色体定位)。Disadvantage:Timeconsuminganddifficult.(标记材料需花费较多人力和较长的时间来培育，难度很大)Limited.(某些植物物种对染色体变异反应敏感)Somevariationcannotbedetected.(还有些变异难以用细胞学方法进行检测)Cytologicalmarkers（3）Biochemicalmarkers生化标记Includesisozyme(同工酶)andequipotentialenzymes(等位酶).Isozyme(同工酶)是指由一个以上基因座位编码的酶的不同形式.譬如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、苹果酸脱氢酶等.Equipotentialenzymes(等位酶)是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。Advantages：Nearlyneutral(近中性)geneticmarkers，对植物经济性状一般没有大的不良影响；Directlyreflectsthedifferencesamonggeneproducts，lessaffectedbytheenvironment.Disadvantages：limited/目前可使用的标记数量相当有限；Someenzymestainingmethodandelectrophoreticseparationtechnologyhavethecertaindifficulty.有些酶的染色方法和电泳分离技术有一定难度。Biochemicalmarkers(4)Molecularmarker(分子标记)AmolecularmarkerisaDNAsequencethatisreadilydetectedandwhoseinheritancecaneasilydetectedandwhoseinheritancecaneasilybemonitored.TheuseofmolecularmarkersisbasedonnaturallyoccurringDNApolymorphism.§8.2DNAMolecularMarkerDNAmarker是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，是DNA水平上遗传多态性的直接反映。In1974，GrozdickerfirstdevelopedDNAmolecularmarkersthatisRestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP,限制性片段长度多态性）.ItisthefirstgenerationofDNAmarkerswhichwasusedbyBostseinforconstructionofmankindlinkagemapin1980.In1982，Simplesequencerepeats（SSR,简单序列重复)wasdevelopedbyHamade.ItisthesecondgenerationofDNAmarkers。In1990，WilliamandWelshdevelopedRandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD,随机扩增多态性DNA).8.2.1HistoryofDNAmarkersIn1991,AdamsdevelopedExpressedsequencetags(EST,表达序列标签标记)一种相对简便和快速鉴定大批基因表达的技术。In1993，ZabeauandVosinventedtheAmplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP,扩增片段长度多态性标记).In1994，ZietkiewiczdevelopedInter-simplesequencerepeat(ISSR,简单重复间序列标记)。In1995，VelculescudevelopedSerialanalysisofgeneexpression(SAGE,基因表达系列分析技术)。In1998，Singlenucleotidepolymorphisms(SNP,单核苷酸多态性标记)wasproducedinIntheprocessofhumangenomeproject(人类基因组计划).Itwasthethirdgenerationofmolecularmarkers.In2001,LiandQuirosdevelopedsequence-relatedamplificationpolymorphism(SRAP,相关序列扩增多态性标记)attheuniversityofCaliforniainUnitedStates.In2003，美国农业部北方作物科学实验室HuandVickputforwardTargetedregionalamplificationpolymorphism(TRAP,靶位区域扩增多态性).目前，DNA分子标记已经发展到几十种。8.2.2ThecharacteristicsofDNAmarkers1.直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否问题；2.数量极多，遍布整个基因组，可检测的基因座位几乎是无限的；3.多态性高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造；4.表现为中性，不影响目标性状的表达；5.许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。Theidealmolecularmarkersrequire:1.Highpolymophism(遗传多态性高)；2.Co-dominant(共显性遗传)，信息完整；3.Abundance(在基因组中大量存在)，且分布均匀；4.neutrality(选择中性,即无基因多效性）；5.Stable(稳定性、重现性好)6.Simple,convenience(检测手段简单、快速)；7.lowcost(开发成本和使用成本低)；8.Highefficiency(信息量大，分析效率高)。8.2.3TypesofDNAmarkerAccordingtodevelopmentprocess,DNAmarkerscanbegroupedinto：第一代以Southern杂交技术为核心的分子标记，如RFLP；第二代以PCR技术为核心的分子标记，如RAPD、SSR、STS、AFLP、CAPS；第三代基于单核苷酸多态性的DNA标记技术，如单核苷酸多态性（SNP）。§8.3PopularDNAMarkersRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)—随机扩增多态性SimpleSequenceRepeat(SSR)—简单重复序列AmplificationFragmentLengthPolymorphism(AFLP)—扩增限制性片断长度多态性Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)—相关序列扩增多态性8.3.1RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,随机扩增多态性)Principle:以PCR为基础，利用9-10bp的脱氧核糖核酸随机序列为引物，以所研究的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后通过染色来检测产物DNA片段的多态性。RAPDAdvantagesanddisadvantagesofRAPD①lesstemplets.(DNA需要量较少，对DNA制备的纯度要求不高，可采用微量、快速提取法)②Simpleanalysisprocedure.(分析程序较简单，周期短，不涉及放射性同位素)③Lowcost(费用较低)④Lowstable.(扩增稳定性较差）8.3.2SSR（simplesequencerepeats,简单重复序列）Principle：利用真核生物的基因组中普遍存在着二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复序列（CA）n、（AT）n、（GGC）n，在不同生物体之间其重复次数不同而产生多态性。重复序列的两侧往往有一小段保守的序列，根据此保守序列可设计特异引物进行PCR扩增，检测简单串联重复序列上的多态性。SSR1234567891012345678910M123456789HowtogetprimersforSSR？Query(查询)：Genbank、EMBL和DDBJ等DNA序列数据库搜索SSR序列。Developing(开发)首先建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，获得SSR座位两侧特异保守区的核苷酸序列，据此