第7章 酶的定向进化-2010

第七章酶的定向进化内容概述定向进化的特点突变技术筛选技术定向进化的应用概述天然酶应用过程中出现问题（改造动机）1天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、缺乏有商业价值的催化功能；2越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程根源:天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会）的需要原始祖先新物种新物种（不定向变异）（定向自然选择）（地理隔离、生殖隔离）实验室进化随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！定向进化:对特定基因直接突变+定向选择定向进化的基本过程第一节定向进化的特点一适合范围广不同于理性设计，要求事先了解酶蛋白结构二目的性强突变针对特定基因定向进行筛选针对特定功能进行，如热稳定性三效果显著短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且进化方向符合人类社会需求。理性设计与非理性设计的对比理性设计（定点突变，杂合）对蛋白结构和功能关系比较清楚，设计一定蛋白结构（如一级结构的氨基酸序列）来改变蛋白功能非理性设计（定向进化）无需知道蛋白结构和功能关系，直接筛选适合（催化）功能的蛋白酶，再了解这些高活力酶蛋白对应的结构半理性设计(semi-rationaldesign)结合了两种方法的优点，它在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突变限制在一个或几个残基上，可以有效的在一个较小的突变库中获得性质改善的突变体，可以大大提高获得阳性突变体的几率理性设计两种方法打通了结构到功能关系，通过结构预测功能或通过功能了解结构，使人类对蛋白结构和功能关系有了更深入的了解，因此成为蛋白工程的两样有力工具因为通过定点突变可以向序列中引入关键残基和结构元件,从而在定向进化中增加有益突变重组的频率。另外,定向进化增加了理性设计知识,从而减少了随机突变的序列空间,甚至为理性蛋白质设计提供突变目标第二节基因的突变技术PCR技术介绍多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB引物dNTPMg2+5’3’Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性-提供单链模板退火-接上杂交引物延伸-高效聚合核苷酸PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火一易错PCR（error-pronePCR)原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATPdGTPdCTPdTTP的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexualevolution)操作手段：１）降低氯化镁的浓度２）是添加氯化锰３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者用核苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸关键：选择适当的突变频率优点：快速、简便、操作方便缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段(800bp）二DNA改组（DNAShuffling)1994，Stemmer等首次提出体外重组技术，又称有性PCR(sexualPCR)、或分子杂交(moleularbreeding)优点：以用重组的方法将存在于许多突变体当中的有益突变快速积累，可以删除个体中的有害突变和中性突变．缺点：改组过程中伴随的较高点突变频率会严重阻碍正突变组合的发现。延伸－基因家族改组(DNAfamilyshuffling):目的基因由单一基因发展为相关基因家族或一组有利突变体,要求基因家族有一定程度上的同源性。基因家族改组使改组效率提高并相应提高基因多样性．体外定向进化改进1：交错延伸技术(StEP)1998年,Arnold等人又建立了一种新的体外重组方法交错延伸技术。原理：用PCR同时扩增多个拟重组的模板序列时,在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间。优点：多样性，操作简单，无需片段纯化，重组发生在单一试管中缺点：依赖于序列同源性，目的基因特异性的PCR条件优化耗时改进2随机引导重组(RPR)1998年,Arnold原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。主要优点：1)合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求等位）,保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机性。2)随机引导的DNA合成不受DNA模板长度的影响,有利于小肽的改造。三基因家族重排技术该重排技术和DNA重排技术大致相同。区别在于基因家族重排所用同源基因重排，而后者使用重同一基因易错pCR获得的点突变进行重排。同源性高，获得杂合体几率低第三节定向进化的筛选技术在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。手段:高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。（对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）普通筛选方式常见的96孔板高通量筛选技术1平板筛选技术1）根据细胞生长情况筛选突变基因热抗生素pH高渗透压低温有毒物及抑制剂OD-MonitorOD值测定传感器2）依据颜色变化筛选颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。碱性条件显色pH8大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一个有色化合物。3）用透明圈筛选突变酶淀粉酶，蛋白酶等分泌后会在平板上产生水解透明圈一般酶活越大，水解圈越大。荧光检测法具有灵敏性高、方法简便的优点，在高通量筛选中被广泛应用，该方法可以使用很稀的底物浓度和极少量的催化剂进行检测。2荧光标签与高通量筛选技术3噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，利于蛋白酶的催化或蛋白分离同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表达型4酵母细胞表面展示技术S.cerevisiae易培养、安全、适用范围广适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量（105-106)展示可溶性蛋白（104-105proteincopies/cell），在细胞表面直接检测蛋白，无须破碎细胞检测在单细胞中实现基因与表型的耦联，易于实现蛋白定向进化的高通量快速筛选（106cells/s）具有固定化酶的特征，易实现酶的定向进化与发酵耦联酵母细胞表面展示体系多肽酶在酵母细胞表层的展示Proteasomesubunit27.4kDaSC112285.4：15.872.6：29.1YQTang,etal各种酶与蛋白在酵母细胞表层的展示5细菌展示技术革兰氏阴性菌的外膜蛋白仅有一些表面环可作为插人外源蛋白的“允许位点”,并且通常只允许插入很短的外源蛋白。单层膜转移阳性菌结构坚固革兰氏阳性菌的一个潜在问题是其转化率较低。6核糖体和mRNA展示第四节定向进化的应用提高酶分子的催化活力提高酶分子的稳定性提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化对映体选择性的定向进化1提高酶的催化活性1994年,Stemmer使β－内酰胺酶对新的底物cefotaxime的活性提高了32000倍．StemmerWPC.,ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:10747-10751一提高酶的催化活性1994年,Stemmer使β－内酰胺酶对新的底物cefotaxime的活性提高了32000倍．StemmerWPC.,ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:10747-10751二酶稳定性-耐有机溶剂2001年，Song和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到三株磷脂酶A1突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的发挥作用,其稳定性和活性都得到较大的提高。SongJK,RheeJS.BiochimBiophysActa,2001,(1547):370～378.Arnold等用定向进化方法提高P450BM3对有机溶剂ＤＭＳＯ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。TuckSengWong,*FrancesH.Arnold,UlrichSchwaneberg,BIOTECH.&BIOENG.,VOL.85,NO.3,FEBRUARY5,2004三改变对映异构体特异性2001年，Reetz小组用易错PCR将脂肪酶在只有一个突变点的低突变率的情况下其对映选择性提高到ee＝81%，当将易错PCR和定点饱和突变相结合在“hotspots”上得到了进一步的提高，有几个突变酶的ee%达到了90-94%。Arnold等利用饱和突变定向技术进化Ｐ４５０ＢＭ３成功获得了几个突变酶，这些突变酶对短链烷烃末短羟基化的立体选择性［(R)-or(S)-］从83%提高到95%。目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜中活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌四创造新的酶活性Sun等利用组合突变改变了半乳糖氧化酶的底物专一性，使其变为能以葡萄糖作为底物。Sun,L.etal.(2002),Chembiochem3,781–783李红梅等采用定向进化技术，改变了单加氧酶结构，使其能催化长链脂肪酸底物变成催化苯环类底物。