免疫血清制备

免疫血清制备中山医学院免疫学教研室实验目的和要求了解影响机体免疫应答强度的因素;明确初次应答和再次应答抗体产生的规律；制备牛血清白蛋白（BSA）的抗血清；熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法；了解抗体检测的常用方法。在免疫学实验中,为制备抗体通常以抗原性物质给动物注射,经一定时间后,动物血清中可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免疫血清。实验原理免疫应答的影响因素抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种的途径有密切关系。一、抗原分子的结构和性质1.分子量：分子量越大，免疫原性越强。2.化学组成及结构（1）蛋白质（2）多糖：具有免疫原性,较蛋白质弱。（3）核酸：多无免疫原性。3.结构的复杂性4.分子构象5.易接近性6.物理状态二、宿主方面的因素1.遗传因素同种动物不同品系及不同个体对同种抗原产生不同强度的免疫应答。2.其他因素年龄、性别与健康状态。三、免疫原的剂量及进入途径（1）剂量1）剂量不足或过多均不引起免疫应答。2）重复进入引起强免疫应答。（2）途径：皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、呼吸道和口服免疫应答水平依次降低。抗体产生的一般规律初次应答和再次应答规律。抗体产生的顺序规律：IgM-IgG-IgA-IgD-IgE初次应答和再次应答抗体产生比较实验方案免疫佐剂制备及动物初次免疫（第一周）再次免疫及血清采集（第二周）血清采集及抗体检测（第三周）W1W2W3未免疫血清采集再次免疫血清采集初次免疫血清采集初次免疫再次免疫实验材料动物：昆明鼠（每组一只），约20g／只。抗原：4mg／ml牛血清白蛋白（BSA)佐剂：完全福氏佐剂。其它：PBS、1ml塑料管（保存血清用），无菌小试管，棉签，1ml注射器、12＃针头等。实验流程12只小鼠小鼠眼眶取血制备血清2只2只8只W1W3W2初次免疫（1只/组）再次免疫1.5mlBSA1.5ml完全福氏佐剂搅拌完全乳化第一周实验步骤1.抗原制备滴于水中经久不散2.动物免疫用1ml注射器12＃针头吸出完全乳化的抗原1ml；换4＃针头双后足垫和背部皮下接种，每处约10-20ul。(接种处先用碘酒、酒精消毒)将免疫后的小鼠放回鼠笼。1ml注射器（内有乳化好的抗原）贴好标签，4℃保存下次用。第一周实验步骤3.采集阴性血清（每班2只）用无菌小试管收集未免疫小鼠血（眼眶放血法），标记后送准备室；2,000rpm离心10分钟;吸取血清置1ml塑料管，做好标记;注意:老鼠断颈椎处死后放到楼梯口的红桶第一周实验步骤第二次课内容抗原抗体反应抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物。物质基础:1）抗原表位与抗体高变区间的互补结合2）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合3）抗原抗体之间的结合力4）亲水胶体转化为疏水胶体抗原抗体结合力静电引力（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体的亲和力和亲合力亲和力：抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力亲合力：抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度亲水胶体转化为疏水胶体抗原抗体的结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。如再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。抗原(亲水胶体)抗体(亲水胶体)抗原抗体复合物(疏水胶体)电解质可见反应+抗原抗体反应的一般规律特异性与交叉反应性；可逆性：表面的结合，有可逆性；抗原抗体交叉反应示意图适比性：适合的比例，反应才可见；阶段性：不可见可见反应；条件依赖性：PH，温度，电解质。抗原抗体反应比例性示意图血清制备：取首次免疫后的小鼠2只，采集血清(方法同上),标记后冻存备用。再次免疫：其余小鼠于腹腔和背部皮下注射上次制备的乳化抗原，每鼠注射0.5ml。第二周实验步骤第三周实验步骤血清制备：采集剩余小鼠血,将血置室温半小时凝固;2,000rpm离心10分钟;吸取血清置1ml塑料管，做好标记.血清抗体检测：以ELISA测定抗体效价，以未免疫鼠血清作对照。Thanks!