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医学微生物学与免疫学实验实验目的和要求一、实验前务必做好预习，明确实验目的、内容及理论依据等，避免或减少错误的发生，以保证实验在预期内完成。二、实验操作严格按要求进行，严防污染和感染。三、对示教实验联系理论认真观察。对光镜下标本不得擅自挪动视野，其他示教标本看后必放回原处。对录像教学应作重点、简要的笔记。四、客观真实地记录实验结果并进行分析，若与理论不符，要加以分析讨论，找出原因，必要时重复实验。五、在规定时间内完成实验报告，报告要求字迹清楚，说明问题简单扼要。实验室规则1.非实验必需品禁止带入实验室。2.穿白大衣，按规定就坐。3.实验室应保持安静和良好的秩序，不得高声谈笑、乱动物品或随便走动。4.实验室内严禁吸烟、进食、饮水或用嘴湿润铅笔和标签等，也不要用手搔抓抚摸机体。5.实验时若不慎发生皮肤创伤，或病原菌污染衣物、卓（地）面等事故，应立即报告指导老师，进行紧急处理。6.实验所用的玻片、试管、吸管等，用后应随即投放盛有消毒剂的指定容器内，不得放在桌上，也不可在水池中冲洗。7.每次实验完毕，按实验要求应及时清理实验物品，清扫卫生；离开实验室时，消毒洗手后离开实验室；对白大衣经常清洗消毒。油镜的使用和维护目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。步骤：显微镜油镜的使用和维护1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。2.打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。3.标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。4.从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。5.观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。革兰染色目的：掌握革兰染色的原理及操作。材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。步骤：1.细菌标本的制作（1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。（2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。（3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片黏附较牢固。菌体蛋白质变性后，提高与染料的亲和力。2.革兰染色（1）初染：滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，1min钟后用自来水缓缓冲洗。（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自来水缓缓冲洗。（3）脱色：加95%酒精数滴，摆动玻片使酒精与细菌充分接触，约20-30s后，立即用自来水缓缓冲洗。（4）复染：滴加稀释碳酸品红液，30-60s后，自来水缓缓冲洗。用吸水纸吸干后，用油镜观察。镜检后，载片放入消毒缸。细菌特殊结构的观察目的：观察并掌握细菌的形态及特殊结构。材料：细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片；革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片示教：革兰阳性菌：葡萄球菌，紫色革兰阴性菌：大肠杆菌，红色细菌鞭毛细菌芽孢细菌荚膜细菌的分布目的：了解细菌在自然界中的分布情况。材料：普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。操作步骤：1.空气中细菌的检查（1）采用沉降法：取普通琼脂平板培养基1只，任意置一处，启盖约15分钟，再盖上，37℃培养24小时，观察有无细菌生长。（2）结果判定：培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。2.皮肤表面细茵检查(1)采用涂抹法:先在平板底面用记号笔分成两区，作标记，将未消毒的手指在平板的1／2处表面轻轻涂抹划线，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，用消毒后的手指在平板另一1／2处进行涂抹，操作完毕，置37℃培养24小时后，取出观察结果。(2)结果判定：培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。3.咽喉部细茵检查(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并划线分离，37oC培养24小时后观察结果。注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象，并可挑取菌落进行革兰染色检查。口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。(2)结果判定：血平板表面有大小和形态不同的菌落，有的菌落周围可见溶血环。牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。紫外线杀菌实验目的：掌握紫外线杀菌的原理，熟悉紫外线杀菌实验的操作。材料：大肠杆菌，琼脂平板，无菌回形状纸片，接种环，镊子，紫外灯.原理：紫外线波长范围为240～280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线特点：紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃。步骤：1.平板密集划线接种。2.在平板上贴无菌回形纸片。3.UV照射30min（打开平板盖子）。4.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。5.37℃培养24h后观察结果。培养基配制目的：掌握细菌生长的营养成分。熟悉培养基的配制。材料：培养基配制的原材料示教：培养基配制过程。细菌代谢产物观察和生长现象目的：掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。材料：各种生化管，大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。原理：不同菌的酶系统不同，对底物的代谢产物也不同，用生化的实验方法可将产物检测出来，从而对细菌鉴定。步骤：一、细菌代谢产物观察1.糖发酵实验将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内，37℃培养18-24h进行观察。培养基中指示剂为溴甲酚紫。如能分解葡萄糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。如能分解乳糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中倒置的小管中有气泡出现，记录符合为“⊕”。如培养基未变色，仍为紫色，则表明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。记录符合“-”。2.枸橼酸盐利用实验该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。指示剂是澳麝香草酚兰。分别接种大肠杆菌和产气杆菌，37℃培养24h进行观察.若斜面有菌落出现，培养基由原来的绿色变为深兰色，表明细菌能利用枸橼酸钠，记录符合“+”，反之“-”。3.靛基质吲哚产生实验能产生色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质。将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，37℃培养48h后，每管各加吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出现红色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基质产生阳性“+”；反之为阴性：“-”。4.硫化氢产生实验有的细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢。将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的培养基中，37℃培养18-24h。若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”，表明产生的硫化氢与培养基中的铅盐(或铁盐)结合，生成黑色的硫化铅（或硫化铁）。二、细菌生长现象1、在液体培养基上生长情况(1)表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。如枯草杆菌。(2)混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。如大肠埃希菌。(3)沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。如链球菌。2、在固体培养基上的生长情况(1)菌苔：在琼脂斜面培养基上长成菌苔。(2)菌落：在平板上形成肉眼可见的细菌集团，称为菌落。观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固体培养基上的生长情况有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长，使穿刺线变得模糊不清。无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种生仍没穿刺生长，穿刺线与周围界限清楚。高压蒸汽灭菌目的：掌握高压蒸汽灭菌的原理及应用范围，了解高压蒸汽灭菌的操作。材料：高压蒸汽灭菌器。原理：高压蒸气灭菌器是一种坚固密闭的蒸锅，锅盖上装有压力计、安全阀及排气孔等。锅盖密闭旋紧后由锅底加热，因蒸气不能外溢，可使锅内压力逐渐增高，从而提高了锅内水的沸点和蒸气的温度。由于高压蒸气的温度较高，放出潜热多，热力穿透能力较强，故其灭菌效能最好。凡能耐热和耐潮湿的物品如培养基、生理盐水、纱布、玻璃器材等都可以应用此法消毒灭菌。讲解（示教）高压蒸汽灭菌器的主要构件：一个能密闭的耐高压的双层金属圆筒，蒸汽压力计，安全阀，排气阀等。步骤：1.先向外筒注入一定量水，需灭菌物品装入内筒，不宜拥挤，以便蒸汽充分回旋。把筒盖拧紧盖严，打开排气阀，开始加热。2.水沸腾后，排气阀打开排出气体，待排气孔急促排出蒸汽，表明冷空腔已排尽，关闭排气阀，此时筒内压力逐渐上升。3.待压力达到所需值时，适时调节热源，使维持一定时间。一般为15磅，温度121.3℃，维持15-30min。4.灭菌达到所需时间后，关闭热源，自然降压（温），待压力表指针降至“0”时，方可开盖取物。注意事项：1.器内的水量适当。2.放入的物品不拥挤。3.排尽冷空气。4.待压力表指针降至“0”时，方可开盖。凝集实验（玻片法）目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉凝集反应的操作。材料：伤寒杆菌A－F群O多价血清、志贺氏痢疾多价血清、生理盐水、未知菌、玻片。原理：颗粒性抗原（凝集原）与相应的抗体（凝集素）直接结合，在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。如红细胞ABO血型的测定，测定细菌的细菌凝集实验。步骤：1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌A－F群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清，第三格内滴加约30ul生理盐水。2.用接种环挑取待检菌种少许，分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。接种环每次使用前后均需经酒精灯火焰烧灼灭菌。3.轻轻摇动玻片，数分钟后用肉眼观察结果，出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。沉淀反应（双扩散）目的：掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性，熟悉沉淀反应的操作。材料：干净玻片，玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG原理：将抗原与抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中，抗原与抗体双方自由扩散，在最适当比例处形成抗原抗体复合物（沉淀线）。步骤：1.制板：取干净玻片一片，用蜡笔分为三格，用吸管将4－5ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格，制备琼脂板。2.打孔：待琼脂板凝固后，用打孔器打孔。孔间距约为5mm。3.封底：将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。4.加样：用微量加样器在三孔中加入生理盐水，正常人血清IgG和马抗人IgG。每孔加入约10μl。注意：加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。5.扩散：将琼脂板放入湿盘内，置37℃温箱中（均保持水平位置），于24小时后观察结果。ELISA（乙肝病毒表面抗原的检测）目的：掌握ELISA的原理，用途，熟悉其操作过程。材料：乙肝病毒表面抗原的检测试剂盒、待检血清、微量加样器等。原理：将酶与抗体（或抗原）用交联剂结合起来，此种酶结合物能与相应的抗原（或抗体）发生特异性结合反应，形成酶-抗原抗体大分子复合物，此时再加入酶底物，底物被酶催化生成有色产物，