真菌感染现状与药物合理应用

真菌感染现状与药物合理应用2013年度执业药师继续教育课程一、前言真菌感染是由真菌引起的人和动物的感染性疾病。引起人类疾病的真菌分为条件致病菌及致病性真菌。一般慢性消耗性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病、尿毒症、艾滋病等患者，机体免疫功能低下，容易引发感染。近年来，临床真菌感染呈上升趋势，主要因素是：人口老龄化，患慢性病如糖尿病、心、肺、脑血管疾病等机体抵抗力下降病人增多，广谱抗菌药物广泛应用，导致机体菌群失调等。抗真菌感染诊断和治疗成为研究热点之一，特别是侵袭性真菌感染日益引起人们的关注。二、真菌简介真菌（fungus，fungi）一词来源于拉丁文的sfungus，即蘑菇同词源的希腊文为Spongis，意思是海绵状物。中文早期称为藫，后称菌，又称真菌。真菌属于真核生物，没有质体（Plastids），营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质（chitin）和β-葡萄糖。线粒体具扁平的突起，常有过氧化物体（Peroxiomes），有高尔基体。有单细胞或菌丝体和多核细胞单倍体的菌丝。双倍体存在的时间很短。营腐生、寄生共生和超寄生（superparasitic，即真菌寄生于其他真菌上)生活。估计在世界上真菌有100～150种。大多数真菌对人类有益，只有少数对人类有害。真菌属于真核细胞，有核膜包裹的核孔复合物，核中有核小体和线性染色体。胞浆中有细胞骨架微丝，大部是由肌动蛋白组成，还有含微管蛋白的微管。胞浆中还有各种细胞器，如线粒体、高尔基体、空泡、囊包、核糖体等。真菌细胞壁的主要物质为碳水化合物，先在质膜上形成，包括一些晶体状的物质，如α-葡萄糖，儿丁质，β-（1，3）葡萄糖联合而成的N-乙酰糖胺聚合物。晶状物可使真菌细胞壁坚固、结实、其他多糖成分包括基质，如甘露糖蛋白，可使细胞壁有通透性。真菌可引起人类、动物的疾病、称为真菌病（mycosis），还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。医学真菌学（medicalmycology）是研究人和动物的真菌病及其致病菌种的方向，是由普通真菌学（generalmycology）发展而来的。目前通过对16SrRNA碱基序列的比较分析，将生物划分为三大超界（domain），即真核超界（Eukaryotes）、细菌超界（Bacteria）和古菌超界（Archaea）。真核超界下面有五个界，即动物界（Animalia）、植物界（Plantae）、真菌界（Fungi）、藻物界（Chromista）和原生生物界（Protozoa）。现代分类只承认真菌界的四个门，即接合菌门（Zygomcota）、壶菌门（Chytridiomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）。对半知菌末予承认，但仍予保留，字首不用大写而用小写，即deuteromycetes。真菌属于真核生物，形态多种多样，可有性生殖和无性生殖。并可借此而鉴别。真菌形态学在真菌鉴定方面起着主要作用，真菌丝顶端生长，产生孢子，有各种不同形态，还有各种色素、大小、形态、分隔等，可作为真菌鉴定的依据。有的真菌不需减数分裂而产孢的是无性世代，即无性期，需要减数分裂产孢的称有性世代，即有性期。真菌孢子和菌丝经大量生长繁殖后可形成真菌集团叫菌落（colony）。真菌菌落主要有以下几种类型:（一）酵母型菌落（yeasttypecolony）：酵母型菌落柔软，光滑，湿润，似奶酪样。在光镜下可见单细胞性的芽生孢子，无菌丝。（二）类酵母型菌落（yeastlikecolony）：类酵母型菌落外观与酵母型菌落一样，但有假菌丝。（三）丝状型菌落（flamentoustypecolony）：丝状型菌落呈绒毛状、海绵状、粉末状等，在光镜下可见有或无隔，分枝或不分枝，有色或无色的各种类型的菌丝。三、真菌感染流行病学1．发病率近年来深部真菌感染逐渐增多，美国国家医院内感染监测中心（NNIS）资料显示，2004年的真菌感染率为20世纪90年代的2.4倍，念珠菌是美国目前院内最常见的第四位导致血液系统感染的病原菌。白念珠菌感染所占的比例逐渐减少而非白念珠菌尤其是光滑念珠菌与克柔念珠菌等唑类不敏感株所致的感染增多。可能与长期、大量使用氟康唑经验性用药有关。我国医院感染监控网的资料显示，在确诊为医院感染的患者中，真菌感染已占17.1％。大约有25％～50％的念珠菌血症发生在ICU，尤其是外科ICU患者中念珠菌血症发病率的增加速度最快。肝脏移植后发生侵袭性真菌感染的几率是7％～24％，其中80％以上是由于念珠菌和曲霉感染。2．真菌感染的危险因素老年、婴幼儿病人及免疫功能低下者患急慢性重病，或接受放化疗和激素易罹患真菌感染。另外，患者住院期间或在院外较长期使用或滥用广谱抗菌药物也是真菌感染的危险因素。在正常情况下，人体正常菌群通过与病原微生物营养竞争抑制病原微生物的生长与繁殖，维持正常的生态平衡。若大量应用广谱抗菌药物，人体正常菌群被杀灭或抑制，使体内机会致病真菌得以恶性繁殖，导致微生态平衡失调，发生医源性真菌感染。3．真菌感染的主要类型真菌感染常见有三种：即呼吸道感染、创伤感染和接种感染。医院真菌感染患者基础疾病中呼吸道疾病居多，多为慢性支气管炎患者，且多为老年人，真菌感染的部位也以呼吸道最为常见，这些患者的呼吸道防御屏障受损，呼吸功能不全，免疫功能低下，真菌在受损的呼吸道黏膜易于定植，一旦菌群失调，内环境紊乱，则造成内源性感染。4．真菌感染的主要菌种引起侵袭性真菌感染最常见的致病菌为念珠菌、曲霉菌、隐球菌等。白念珠菌分布于口腔、肠道、阴部等处，是具有代表性的条件致病菌，它能分泌出一些酶类，使其侵入人体的过程变得容易，也能保护自身的生长繁殖。从住院患者体内分离出的真菌主要为白念珠菌，其次为克柔念珠菌，热带念珠菌等。烟曲霉也是侵袭性真菌感染的主要病原菌，但近些年其他菌种如黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的比例在不断增加。在2009年的一项对造血干细胞移植和器官移植患者进行的研究中，烟曲霉感染所占侵袭性曲霉感染的比例为56％，黄曲霉为19％、土曲霉为16％，烟曲霉所占比例较1985年的82％和2001年的66％均有较大下降。在中东、非洲以及东南亚，黄曲霉是引起侵袭性曲霉感染的主要病原菌。在另一项关于免疫抑制人群中曲霉感染情况的大样本调查中，土曲霉的感染率有上升趋势，土曲霉感染率增高与其对两性霉素B耐药有关。非曲霉属引起的感染与曲霉属相比要少，但近年来有增加的趋势。近来的研究显示，很多以前不致病的非曲霉丝状真菌，现在也能够引起导管介导的菌血症以及深部脏器的播散性感染。根据引起侵袭性丝状真菌感染的发生率排名，依次为镰刀霉属、赛多孢霉属和接合菌。5．真菌耐药现状由于抗真菌药物的广泛应用，真菌对常见抗真菌药物敏感性有所下降。白念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌对伏立康唑和氟康唑较敏感，而光滑念珠菌对氟康唑耐药率较高。克柔念珠菌对氟康唑存在高耐药率。热带念珠菌对唑类的交叉耐药性较其他几种念珠菌要高。四、真菌感染诊断1．真菌病的组织病理学诊断真菌病的病理学检查在临床上非常重要，特别是在诊断深部真菌感染时意义尤为重大。一般除有科研需要，浅部真菌感染不需进行病理检查，而当怀疑有深部感染时通过病理活检确定真菌感染并将其进行分类鉴定则是诊断的金标准。近年来随着广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制药物的广泛应用，中心静脉导管、介入疗法及器官移植的广泛开展，以及糖尿病、艾滋病的不断增多，导致免疫抑制人群大量增加，深部真菌感染包括过去认为是无害的腐生菌或污染菌的感染日益增加。该病病情严重、危害大，免疫抑制患者死亡率很高。由于缺乏特异的临床表现，常规的检查手段如血生化，胸部X线检查等往往难以发现病因，易被误诊为炎症、肿瘤等其他疾病。早期诊断、早期治疗能降低死亡率。真菌培养为确定真菌菌种常用而有效的方法，但耗时长，在培养结果为污染菌时则难以确定。临床上常由于未怀疑到真菌感染使活检组织标本固定进行病理检查，失去了培养的机会，对于某些真菌即使送检也常遇到难以培养出致病菌的情况。当怀疑有深部真菌感染时，临床上可以通过手术、针吸活检技术或内镜等手段获取组织标本。组织病理学可根据在组织总发现真菌病原体及局部组织反应来诊断真菌感染，判断是致病菌还是单纯的正常寄生菌群，如条件致病性真菌感染的诊断，还是环境污染菌所致，如曲霉或接合菌的一些菌种的感染。另外还可通过评价组织中炎症反应与真菌分布来确定疾病为侵袭性感染或只是单纯的过敏反应如侵袭性或过敏性支气管肺曲霉病。还能够帮助确定真菌在体内的传播范围、器官受损程度、鉴定病变是局限性感染还是系统性感染，因而成为诊断深部真菌感染的最可靠方法，可称之为金标准。应用组织病理学方法正确诊断真菌感染要依靠多方面的因素包括不同的致病菌种，选用适当的染色剂和染色方法，病理大夫的专业经验等等。真菌的组织病理学检测方法包括传统的HE染色，各种特殊染色方法，免疫组织化学技术及正在探索中的分子生物技术等。传统的HE染色组织反映清晰，病理变化良好，但真菌着色程度不同，一些暗色真菌由于本身的颜色，HE染色可以观察到，曲霉和接合菌染色尚可。大部分真菌不着色或着色较浅，当真菌菌量较少时，很易漏诊。所以经常需要应用特殊染色方法，包括过碘酸-雪夫染色（PAS）、嗜银染色（GMS）、Grid-leyfungus染色（GF）、革兰染色和粘蛋白卡红染色、Fontana-Masson黑素染色等。通过特殊染色和适当的复染后，真菌的特殊形态可在组织中形成明显的反差，从而可以确定真菌感染的诊断。PAS染色是组织病理学技术中最常用的真菌特殊染色法。以亮绿或苏木素复染，真菌着红色，组织中细胞核着绿色或蓝色。但该法除能染真菌外，还能染组织中的各种糖类，如糖原、淀粉、纤维素、粘蛋白筹，特别是在皮肤、肝脏等含糖原较多的组织中易与真菌成分发生混淆，背景不干净。根据真菌耐淀粉酶，其他物质不耐淀粉酶的原理，最好先以0.5％淀粉酶消化15～20分钟。将糖原消化后再染色。PAS染色切片会随时间推移而褪色，不能长期保存。GF染色原理与PAS染色基本相同，都是因真菌细胞壁由糖类构成而呈阳性反应。只是以铬酸而非过碘酸氧化，复染应用皂黄，因此背景为黄色，真菌成分染成红色。GMS染色真菌壁着黑色，与周围组织反差大，是真菌感染很好的筛选方法。与PAS及GF染色法不同的是GMS法可染陈旧无活性的真菌以及非真菌性致病菌，如放线菌属、诺卡菌属、卡氏肺孢子虫的孢囊、分枝杆菌属等。染色切片可以长期保存不褪色。染色时注意根据不同的病原菌寻找最佳染色时间，控制染色深度，防止过染，最好设臵阳性对照切片。过染会使真菌成分与周围组织成分混淆，如分支的血管基底膜被染黑很像真菌菌丝。过染的红细胞、白细胞、细胞裸核极易与酵母细胞混淆等等。以GMS结合HE复染，可以充分显示真菌与感染组织的反映情况且照片效果理想。粘蛋白卡红染色法用来鉴定新生隐球菌多糖荚膜，是区分新生隐球菌和与其形态大小相似的无荚膜酵母菌的常用手段。粘蛋白卡红染色法并非特异针对新生隐球菌，其他真菌的细胞壁如皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、鼻孢子菌等都可有不同程度的染色反应，根据他们无荚膜及形态上各自的特征，容易与新生隐球菌鉴别。银浸染法即Fontana-Masson黑素染色法在病理染色技术中常用来检查黑色素及其他嗜银颗粒。一些真菌如新生隐球菌或暗色真菌的细胞壁含有黑色素或还原银成分，因此可通过该法鉴别缺乏荚膜的新生隐球菌。当暗色真菌HE染色末显示出颜色或颜色很淡时，此法能够加深其本身的颜色以确定暗色真菌的感染。以钙荧光白（Calcofluorwhite）等发光剂进行染色，真菌成分会在紫外线灯下发出荧光，可用于体液新鲜冰冻或石蜡包埋组织切片、涂片等标本中真菌的染色，从而可检测深部真菌感染。该法无特异性，但快速简便。总之，应用HE染色和各种特殊染色方法，根据真菌各自不同的形态学特征及组织反映情况，可以提示真菌感染的存在，有时还可确定真菌的类别，但是许多致病真菌的形态在组织中非常相似，如感染组织中的曲霉与毛霉、镰刀菌形态