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中国医科大学硕士学位论文5氮杂胞苷对化疗药长春新碱及环磷酰氨诱导NB细胞凋亡的调节作用姓名：张家魁申请学位级别：硕士专业：小儿外科指导教师：王维林200705015氮杂胞苷对化疗药长春新碱及环磷酰氨诱导NB细胞凋亡的调节作用作者：张家魁学位授予单位：中国医科大学相似文献(4条)1.期刊论文刘建秋.李爱敏.张继红.LIUJian-Qiu.LIAi-Min.ZHANGJi-Hong5-氮杂胞苷增强阿霉素对神经母细胞瘤细胞的抗瘤活性-中国当代儿科杂志2007,9(6)目的许多神经母细胞瘤细胞系及肿瘤组织标本中caspase-8表达缺失,caspase-8基因沉寂的主要原因是其启动子区域高度甲基化.该文探讨去甲基化药物5-氮杂胞苷对caspase-8表达及对化疗药阿霉素抗人神经母细胞瘤细胞作用的影响及其影响机制.方法应用RT-PCR方法检测5-氮杂胞苷作用前后SH-SY5Y细胞中caspase-8mRNA水平变化.MTT分析研究5-氮杂胞苷与化疗药阿霉素联合应用前后人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的存活率,以及加入caspase-8活性抑制剂后存活率的变化.结果RT-PCR方法发现SH-SY5Y细胞株不表达caspase-8mRNA,5-氮杂胞苷作用3d后可检测到caspase-8mRNA表达,5d后表达较第3天增加;5-氮杂胞苷与不同浓度阿霉索(0.05,0.1,0.25,0.5μg/mL)联合应用后SH-SY5Y细胞存活率为(77.61±7.30)%,(57.35±6.64)%,(46.25±4.46)%,(35.59±5.12)%,同一浓度单独应用阿霉素组细胞存活率为(94.89±4.15)%,(80.60±8.50)%,(64.48±4.92)%,(52.32±6.71)%,5-氮杂胞苷与阿霉素联用组细胞存活率明显低于单用阿霉素组,差异均有显著性.caspase-8抑制剂组与同一浓度的5-氮杂胞苷+阿霉素组比较,细胞存活率明显增加,依次为(92.95±3.48)%,(78.39±4.28)%,(62.31±6.50)%,(49.92±5.77)%,差异均有显著性.结论阿霉素对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y具有增殖抑制作用,5-氮杂胞苷可以增强阿霉素的抗瘤活性.其发生机制可能是通过上调caspase-8mRNA的表达而实现的.2.学位论文佟海侠Caspase8在TRAIL-死亡受体途径中诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的作用2006目的：神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童常见的颅外实体瘤，年龄超过1岁、伴随1号染色体短臂杂合性缺失、有N-MYC扩增的NB患儿预后不良，且对目前疗法包括外科手术、化疗、干细胞移植等的疗效不是十分理想，其中对传统化疗耐药和肿瘤转移扩散是临床面临的主要难题。因此临床上不断探索新的抗肿瘤方法，通过激活肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)途径诱导肿瘤细胞凋亡可能成为NB治疗的一个热点。TRAIL的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性使其具有良好的临床应用前景，而且已有众多研究报道TRAIL与γ-干扰素(Interferonγ，IFNγ)或细胞毒药物联用可明显提高各种耐药的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族中的一员，与TNF、FASL(FAS配体)不同的是TRAIL能诱导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡而对正常细胞无诱导凋亡作用。正常情况下，TRAIL粘附于5个受体，死亡受体(deathreceptor，DR)DR4、DR5，诱捕受体(decoyreceptor，DcR)DcR1、DcR2及护骨素(osteoprotegerin，OPG)，诱捕受体与死亡受体相似，但缺乏功能性细胞内死亡区域，不引起凋亡级联反应。TRAIL通过黏附于死亡受体启动半胱-天冬氨酸蛋白酶(cysteinecontainingasparatespecificprotease，Caspase)级联反应导致程序化细胞死亡。在这一过程中死亡受体的活化导致Caspase8的激活，通过细胞内一种叫做FAS相关蛋白的细胞内媒介蛋白，活化的Caspase8直接激活效应Caspase-Caspase3，引起NB细胞凋亡。大多数NB细胞株因其Caspase8表达的缺失而对TRAIL诱导的凋亡不敏感。NB细胞中Caspase8基因沉寂的原因是其启动子区域高度甲基化，如何恢复NB细胞中Caspase8的表达及其对TRAIL的敏感性成为当前NB研究的一个热点问题。本研究中我们用去甲基药5氮杂胞苷(5-Aza-cytidine，5AZA)、IFNγ、TRAIL及化疗药联合作用于NB细胞株CHP212、SH-SY5Y(SY5Y)、SKNDZ，探讨NB细胞对TRAIL抵抗的分子机制，以及联合用药是否可以克服肿瘤耐药性，为TRAIL的临床应用提供理论依据。方法1.RT-PCR检测5AZA、IFNγ作用前后Caspase8mRNA的表达及IFNγ作用前后TRAIL、TRAIL受体DR5和其它凋亡相关基因的表达。2.细胞免疫组化方法及免疫印记实验(Western-blot)检测5AZA、IFNγ作用前后Caspase8蛋白的表达；并用Western-blot技术检测CHP212、SY5Y、SKNDZ细胞DR5蛋白的表达及化疗药处理后SKNDZ细胞DR5蛋白的表达。3.MTT细胞毒实验分组如下：(1)以5μmol/L5AZA培养5d的SY5Y细胞为实验组，未用药物处理的细胞为对照组，分别给予0、50、100和200μg/LTRAIL处理12、24和48h。同时设抑制剂组(5μmol/L5AZA处理5d后，先加Caspase8抑制剂zIETD-FMK预处理1h后再用不同浓度TRAIL处理24h)。(2)CHP212细胞实验分3组：不同浓度TRAIL处理24h组；100μg/LTRAIL作用不同时间组；Caspase8抑制剂组。SY5Y细胞实验分4组：单用不同浓度IFNγ处理48h；100μg/LIFNγ处理48h后，再用50、100、200μg/LTRAIL处理24h；单用不同浓度TRAIL处理24h；Caspase8抑制剂组，即用IFNγ处理48h后先加zIETD-FMK(5μmol/L)预处理1h再加不同浓度TRAIL继续培养24h。(3)经阿霉素(0.5mg/L)、依托泊苷(5mg/L)处理24h后存活的SKNDZ细胞，实验分组如下：对照组(未用化疗药处理)，阿霉素组，依托泊苷组，以上三组分别用TRAIL(200μg/L)、IFNγ(100μg/L)、IFNγ(100μg/L)+TRAIL(50、200μg/L)处理48h。4.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率5.比色法测定Caspase8相对活性6.透射电镜检测细胞凋亡形态7.统计分析采用SPSS11.5统计软件，计量资料用-x±s表示，用单因素方差分析(ANOVA)比较各实验组与对照组的统计学差异，所有实验结果均来自3次重复实验以上，以P＜0.05表示统计学显著差异。结论：1.5氮杂胞苷可诱导SY5Y细胞Caspase8mRNA及蛋白的表达，Caspase8mRNA表达随时间延长而逐渐升高。IFNγ可诱导NB细胞Caspase8mRNA及蛋白的表达，Caspase8mRNA表达随时间延长而逐渐升高。2.CHP212细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感，有时间及剂量依赖性。经5氮杂胞苷、IFNγ诱导表达Caspase8的SY5Y细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感，并伴随Caspase8活性的增加。5氮杂胞苷、IFNγ能增强SY5Y细胞对TRAIL的敏感性，其发生机制可能与Caspase8表达上调有关。3.SKNDZ细胞未检测到DR5蛋白表达，而阿霉素、依托泊苷处理24h后检测到DR5蛋白表达；经IFNγ诱导表达Caspase8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感，而同时表达Caspase8和DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感并伴随Caspase8活性的增加。IFNγ与化疗药联用可逆转SKNDZ细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受，其发生机制可能是通过IFNγ上调SKNDZ细胞Caspase8表达及化疗药诱导死亡受体DR5蛋白的表达而实现的。3.期刊论文张继红.佟海侠.陆春伟.李爱敏.张锦华.ZHANGJihong.TONGHaixia.LUChunwei.LIAimin.ZHANGJinhua去甲基药、化疗药及TRAIL联合诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究-中华神经外科疾病研究杂志2007,6(2)目的探讨去甲基药5-氮杂胞苷、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及化疗药联合诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y(SY5Y)凋亡的作用及其发生机制.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测5-氮杂胞苷作用前后SY5Y细胞caspase-8的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTY)比色法及流式细胞仪检测TRAIL、5-氮杂胞苷+TRAIL、5-氮杂胞苷+caspase-8抑制剂zIETDFMK+TRAIL及5-氮杂胞苷+化疗药+TRAIL对SY5Y细胞生长及凋亡的影响.结果SY5Y细胞不表达caspase-8,5-氮杂胞苷作用1、3、5、7d的SY5Y细胞caspase-8表达逐渐增加.SY5Y细胞对TRAIL不敏感,经5-氮杂胞苷诱导表达caspase-8的SY5Y细胞对TRAIL敏感;化疗药可增强SY5Y细胞对TRAIL的敏感性.结论5-氮杂胞苷可通过上调SY5Y细胞caspase-8表达而逆转SY5Y细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受,化疗药可进一步增强TRAIL对SY5Y细胞的诱导凋亡作用.4.期刊论文佟海侠.张锦华.张继红.陆春伟.TONGHai-xia.ZHANGJin-hua.ZHANGJi-hong.LUChun-wei5氮杂胞苷诱导NB细胞Caspase8表达及对TRAIL敏感性的研究-肿瘤防治杂志2005,12(22)目的:探讨5氮杂胞苷(5-Azacytidine)对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)诱导神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞株SH-SY5Y凋亡的影响及其发生机制.方法:应用RT-PCR方法检测5氮杂胞苷作用前后SY5Y细胞Caspase8的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测TRAIL、5氮杂胞苷+TRAIL、5氮杂胞苷+Caspase8抑制剂+TRAIL对SY5Y细胞生长及凋亡的影响.结果:SY5Y细胞不表达Caspase8,5氮杂胞苷作用1、3和5d的SY5Y细胞Caspase8表达逐渐增加;SY5Y细胞对TRAIL不敏感,经5氮杂胞苷诱导表达Caspase8的SY5Y细胞对TRAIL敏感,并呈现一定的时间和剂量依赖性.联合用药组细胞凋亡率分别为(28.6±4.0)%、(38.5±4.2)%和(42.3±6.2)%,与单独用TRAIL组[(9.5±2.0)%、(10.7±1.8)%和(11.2±1.5)%]比较,差异有统计学意义,F值分别为41.131、45.014和49.405,P值均为0.000;Caspase8抑制剂组细胞凋亡率分别为(11.8±2.0)%、(13.5±2.9)%和(15.1±3.4)%,与相应浓度的5氮杂胞苷+TRAIL组相比,细胞凋亡率明显降低,F值分别为41.131、45.014和49.405,P值均为0.000,说明Caspase8抑制剂可明显降低TRAIL对表达Caspase8的SY5Y细胞的杀伤作用.结论:5氮杂胞苷能增强SY5Y细胞对TRAIL的敏感性,其发生机制可能与Caspase8表达上调有关.本文链接：授权使