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离子色谱在2010版中国药典中的应用关注药物安全关爱您的健康戴安中国有限公司●肝素钠●帕米磷酸二钠●氯膦酸二钠及其制剂●盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷目录1、离子色谱法针对肝素钠的测定...........................................2a)肝素钠的离子色谱法鉴别..................................................................2b)肝素钠中有机杂质分析-半乳糖胺限度测定..................................................32、帕米磷酸二钠离子色谱法测定...........................................43、氯膦酸二钠及其制剂的含量与有关物质离子色谱法测定........................54、离子色谱电导检测法检测盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷......................65、附录...............................................................7a)2010版中国药典附录VJ离子色谱法..........................................................7b)美国药典有关肝素钠检测..................................................................9●1●2010年7月1日开始执行的中华人民共和国药典2010版与以往药典最大的不同之一是新增了离子色谱检测法，同时在附录中增加了离子色谱检测方法及说明。戴安公司作为世界上先进的离子色谱技术的研发及制造者，为满足用户各种分析需求，提供完整的离子色谱解决方案以及多型号的离子色谱仪，本资料汇集了2010版药典有关离子色谱的检测项目，并附录了药典中对离子色谱技术的描述，用以方便广大用户参考。肝素钠的离子色谱法鉴别（本方法符合2010版中国药典1以及美国药典方法2）肝素钠中多硫酸软骨素的测定是这次2010年中国药典中新增的肝素钠测定的内容，主要针对肝素钠以及肝素钠注射液中多硫酸软骨素的鉴别以及含量确定，同时该方法也与美国药典方法相似：离子色谱针对肝素钠的测定●2●色谱条件：●IonPacAS11戴安阴离子分析柱，250×2mmIonPacAG11戴安阴离子保护柱，50×2mm●淋洗液A：0.04%NaH2PO4，pH3.0●淋洗液B：0.04%NaH2PO4/14%NaClO4，pH3.0●二元梯度0min，80%A；60min，10%A；61-75min，80%A；●流速：0.22mL/min●进样体积：10µL实际样品测定谱图肝素钠产品中多硫酸软骨素的测定（按照2010年中国药典以及美国药典方法）样品前处理：取样品，制成20mg/mL的水溶液。图1.系统适用性实验谱图：溶液组成：0.2mg/mL硫酸皮肤素（DS）；0.2mg/mL多硫酸软骨素（OSCS）；20mg/mL肝素钠（Heprin）肝素钠粗产品中多硫酸软骨素的测定（参考2010版中国药典以及美国药典方法）图2.肝素钠产品谱图180mAU15010050-200.010203040506012:DS3:HEPRIN4:OSCSSTDWVL:202nm7075min160mAU1:HEPRIN样1WVL:202nm1251007550250-200.01020304050607075min样品前处理：称取样品0.1g，加水2.5mL，混匀溶解后加2.5mL乙腈，混匀后，于冰箱中沉降10min，取出后用10000rpm高速离心机离心10min，取上层清液4mL，用氮气吹干后，用水定容至8mL，定容后的液体过0.22µm尼龙滤膜，之后过OnGuardRP柱，滤液上机分析。图3.肝素钠粗产品中的多硫酸软骨素的测定-200020040060080010001200mAU3号样WVL:202nmmin0.01020304050607570minWVL:202nm3号样mAU38.035.030.025.020.016.035.036.337.538.840.041.342.543.845.046.347.548.850.0A-42.707●3●肝素钠中有机杂质分析-半乳糖胺限度测定（符合美国药典方法2）戴安离子色谱符合美国药典针对肝素钠中的葡萄糖胺以及半乳糖胺的杂质进行分析的方法。色谱条件：●AminoTrap氨基酸捕获柱，50×4mmCarboPacPA20分析柱，150×3mm●淋洗液：0-10min，14mMNaOH；10.1-15min，200mMNaOH；15.1-20min，14mMNaOH●流速：0.5mL/min●Au工作电极pH-Ag-AgCl参比电极●标准糖四电位波形●进样体积：10µL图4.系统适用性实验谱图溶液组成：1.6mg/mL葡萄糖胺；16µg/mL半乳糖胺；均溶于5NHCl。二者等体积混合。实际样品测定谱图肝素钠中半乳糖胺限度测定样品前处理：称取12mg肝素钠，于10mL玻璃管中，加5mL5N盐酸溶解，密闭。100度加热样品溶液6小时，冷却至室温，转移溶液于500mL容量瓶，用水稀释至刻度，过0.22µm滤膜后进样。肝素钠粗品中半乳糖胺的测定样品前处理：精密称取肝素钠适量，于10mL玻璃管中，加5mL5N盐酸溶解，密闭。100度加热样品溶液6小时，冷却至室温，加水稀释100倍，过0.22µm滤膜后进样。图5.肝素钠产品中半乳糖胺限度测定谱图1-人血白蛋白-甘露糖-090715#2222-人血白蛋白-甘露糖-090715#223heparin-3heparin-3ED_1ED_1nC0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.070.060.050.040.030.020.010.00.0-10.0121-GalN3-GlcN4-GaI5-Man图6.肝素钠粗品中半乳糖胺限度的测定谱图离子色谱针对肝素钠的测定1-半乳糖胺2-葡萄糖胺1肝素钠-糖胺-090428#55ED_1_Totalmin0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00602004080100nC4.275.006.007.008.008.1511.4112.0013.0014.0014.43肝素钠-糖胺-090428#5511-半乳糖胺2-葡萄糖胺ED_1_Totalmin1-半乳糖胺2-葡萄糖胺1%半乳糖胺肝素钠-糖胺-090428#59ED1TotalminnC0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00602004080100120帕米磷酸二钠离子色谱法测定（符合2010年中国药典方法3）2010年中国药典方法中针对帕米磷酸二钠注射液以及注射用帕米磷酸二钠中帕米膦酸二钠含量测定有了确定的方法：●色谱柱：IonPacAS22戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPacAG22戴安阴离子保护柱，50×4mm●检测器：非抑制型电导检测器●淋洗液：3mM草酸●流速：1.2mL/min●进样体积：25µL图7.标准浓度100ppm，500ppm及1000ppm的帕米膦酸二钠色谱叠加图µS0.01,850121,7001,6001,4501.32.53.85.06.37.58.810.031-帕米磷酸二钠#95[modifiedbygzlab]2-帕米磷酸二钠#98[modifiedbygzlab]3-帕米磷酸二钠#100[modifiedbygzlab]ECD_1ECD_1ECD_11-帕米磷酸-5.697min●4●氯膦酸二钠及其制剂的含量与有关物质测定（符合2010年中国药典方法4）2010年中国药典中增订了氯膦酸二钠及其胶囊与注射液中的氯膦酸二钠的含量测定，规定的离子色谱条件：●色谱柱：IonPacAS11戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPacAG11戴安阴离子保护柱，50×4mm●淋洗液：KOH等度淋洗：45mM●柱温：30℃●流速：1.2mL/min●检测器：电导检测器●抑制器：ASRS3004mm●进样体积：25µL图8.氯膦酸二钠标准溶液色谱图图9.系统适用性测试谱图-2.00.001.002.003.004.005.006.007.008.009.005.010.015.022.025 µL有关物质测定规定的色谱条件：●色谱柱：IonPacAS11戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPacAG11戴安阴离子保护柱，50×4mm●淋洗液：KOH梯度淋洗（0-20min，20-50mM；24-25min，50-20mM；25-30min，20mM）●柱温：30℃●流速：1.2mL/min●检测器：电导检测器●抑制器：ASRS3004mm●进样体积：25µL供试品溶液（1.2mg/mL无水氯膦酸二钠）对照溶液（12µg/mL无水氯膦酸二钠）取氯化钠、亚磷酸与磷酸对照品，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml中含氯离子0.6µg、亚磷酸6µg与磷酸6µg的溶液，作为对照品溶液(1)、(2)和(3)。-2.000.05.010.015.020.025.030.0-1.000.001.002.003.004.005.00氯硫酸碳酸亚磷酸磷酸相关杂质1相关杂质2相关杂质3氯磷酸●5●氯膦酸二钠及其制剂的含量与有关物质测定离子色谱电导检测法检测盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷（符合2010版中国药典方法5）2010版药典中对盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷的检测方法为电导检测法样品处理：N-甲基吡咯烷标准溶液，称取一定量标准品，用10mM硝酸稀释到所需浓度。样品称取0.088g溶解在10mL淋洗液中。直接进样。进样速度：0.9mL/min色谱柱类型：阳离子柱IonPacCS15，25µL定量环检测方式：CSRS抑制型电导检测，外加水模式淋洗液组成：9mMHNO3+15％乙腈峰名浓度（ppm）样品中百分比含量4-N甲基吡咯烷9.170.10%样品中百分比含量=测得样品溶液浓度×溶液体积/样品称取量标准溶液色谱图样品溶液色谱图注释：1、参见2010版药典366页2、参加本资料附录二3、参见2010版药典457-459页4、参见2010版药典1034-1035页5、参见2010版中国药典671页●6●1-N甲基吡咯烷061205#380.9*9+15%标准14ppmECD_1minµS0.02.55.07.510.012.514.9-0.502.003.503-未知1061205#36[由a修改，手动指派1]ECD_1minµS0.4-1.006.005.010.015.020.025.033.42.502-N甲基吡咯烷1-Na4-未知2附录一：2010版中国药典附录VJ离子色谱法2010版中国药典附录VJ离子色谱法离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后，经过抑制器或衍生系统进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。离子色谱法常用与无机阴离子、无机阳离子、有机酸、醇糖类、氨基糖类、氨基酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。它的分离机理主要为离子交换，即基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换；离子色谱法其他分离机理还有形成离子对、离子排阻等。1、对仪器的一般要求离子色谱仪器中所有与洗脱液或供试品接触的管道、器件、均应使用惰性材料，如聚醚醚酮（PEEK）等。仪器应定期检定并符合有关规定。（1）色谱柱离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种，分别是有机聚合物载体和无机载体填充剂。有机聚合物载体填充剂最为常用。填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙