荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制1.绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。*Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系*由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量2.绝对定量标准品标准品的一些标准*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同*标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）*标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）*在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。3.标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法：1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4.实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55×108copy/ul标准曲线的绘制（1cycle=1min）设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照PCR反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线标准品的标准曲线图XLog7654321YCT值12.0114.8917.9221.1824.5627.8931.25扩增效率（E）计算：E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7=50118copies核酸拷贝数的计算一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA50ug/ml=ssDNA33ug/ml=ssRNA40ug/ml核酸浓度＝(OD260)×(dilutionfactor)×[33或40或50]=ng/ulMW代表克/摩尔，单位dolton：1dolton即表示1g/mol1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)ssDNA=(碱基数)×(330道尔顿/碱基)ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)得到拷贝数计算公式：(6.02x1023拷贝数/摩尔)×(浓度)/(MWg/mol)=copies/ml.即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNAlength×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNAlength×660)=copies/ul.例：3000碱基质粒，浓度100ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔数copy数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……什么是拷贝数？如何计算拷贝数？计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MWg/mol)=copies/ml[平均分子量(MWg/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]