第04章药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法的验证样品（包括生物样品）的前处理定量分析方法及验证内容第一节样品的前处理方法哪些药品需要前处理何为不经有机破坏处理何为有机破坏处理生物样品前处理一、需要前处理的样品含金属药物：富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠、枸橼酸铋钾、葡萄糖酸锌、酒石酸锑钾等。含卤素药物：泛影酸、三氯叔丁醇、碘番酸、磺溴酞钠等。生物样品：血样、尿液、唾液、头发等含金属或卤素、氮、硫、磷的药物，在分析前需要经过不同方法处理之后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异。如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固。分析含金属或卤素、氮、硫、磷等元素的有机药物之前，需进行适当的样品前处理：1.不经有机破坏的分析方法2.经有机破坏的分析方法而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，如有机结构部分不干扰分析时，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定；二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物，在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。二、不经有机破坏处理的分析方法直接测定法适用于金属原子不直接与碳原子相连的或某些C—M键结合不牢固的有机金属药物经氧化还原后测定法（Zn）适合于卤素结合于芳环上的药物经水解后测定法适合于卤素与脂肪碳链相连的药物适用于金属原子或卤素与碳原子结合牢固的有机金属药物。湿法破坏干法破坏三、经有机破坏处理的分析方法高温炽灼法氧瓶燃烧法1.湿法破坏：（含氮有机合成药物）（1）硝酸-高氯酸法（2）硝酸-硫酸法（3）硫酸-硫酸盐法（4）其它湿法注意：•湿法破坏的仪器一般为凯氏烧瓶；•试剂应不含被测离子或干扰测定的成分；•由于矿酸量数倍于样品，须做空白实验校正；•操作须在通风橱内进行。2.高温炽灼法适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。经高温灼烧灰化，使有机结构分解而待测元素转化为无机元素3.氧瓶燃烧法（Oxygenflaskcombustionmethod）将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定NaClHClOClCNaOH2溶液点燃适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析仪器装置铂金丝硬质玻璃燃烧瓶样品无灰滤纸透明胶纸燃烧、催化称样燃烧分解操作（通O21-2min，燃烧）吸收液水-NaOH（含碘、溴、氯药物）例盐酸胺碘酮、碘苯酯、甲状腺粉水-H2O2（含硫药物）例磺溴酞钠水（含氟药物）硝酸溶液（含硒药物）第二节定量分析方法化学分析法光谱分析法色谱分析法重量分析法容量分析法紫外分析法UV荧光分析法FIA高效液相色谱HPLC气相色谱GC容量分析法（滴定）概念：一定浓度的滴定液由滴定管加到待测药物溶液中，按化学计量反应完全。根据滴定液浓度、体积及化学计量计算被测药物含量。关键问题：等当点的确定。滴定点——指示剂显示的滴定终点（指示剂的变色点）等当点——反应的化学计量点（消耗的滴定液的摩尔数＝被测物摩尔数）特点：操作简便、快速、实验条件易实现，测定结果准确，相对误差小于0.2%，但是专属性差，通常用于高含量和中含量药物，应用于化学原料药的含量测定。滴定方式直接滴定法剩余滴定法置换滴定法含量的计算：定量关系：aAbB被测药物滴定液化学计量关系nA/a＝nB/bWA/aMA＝WB/bMB滴定度：1mL某物质的量浓度的滴定液相当于被测药物的重量，中国药典用mg表示。滴定度的计算：T→滴定度(mg/ml)c→滴定液浓度(mol/L)M→被测物质分子量√√IIVitCH去氢抗坏血酸2l)8.806(mg/m11176.13050.MCTba以I2（0.05mol/l）计，反应摩尔比1∶1例直接滴定法含量％＝×100％实际工作中配制的滴定液浓度与药典中的规定浓度不一致，须引入滴定液浓度校正因子(f)F＝含量％＝基于滴定度的百分含量计算：√若异戊巴比妥钠的取样量为0.2052g依法用F=1.010的硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定，消耗8.10ml，则异戊巴比妥钠的含量已知：每1ml硝酸银滴定液（0.1mo1/L）相当于24.83mg的异戊巴比妥钠例回滴定法加入滴定液A与被测药物完全反应，再以滴定液B回滴剩余的滴定液A滴定液A与滴定液B的浓度是相当的，根据消耗回滴的滴定液体积进行计算本法需进行空白试验校正含量％＝×100％光谱分析法利用物质的光谱特性进行定量介绍两种光谱分析方法：紫外－可见分光光度法分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态跃迁到高能量的激发态，在相应波长位置出现吸收带形成的光谱，称为紫外-可见吸收光谱紫外吸收光谱图紫外－可见分光光度法波长范围200－760nm定量分析基本原理：朗伯-比尔定律A=ECL特点：灵敏度高(10-4～10-7g/mL)；准确度高；仪器便宜；易操作（一）对溶剂的要求A尽量小（二）空白对照试验清零（三）测定波长确证±2nm（四）供试液的浓度A=0.3~0.7吸收度的测定要求√含量测定•吸收系数法（不需要对照品）测定λ处吸收度，以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量％＝×100％lcEA%1cm1LEAg/100mlC%1cm1）（100LEAg/mlC%1cm1）（√盐酸氯丙嗪含量测定:精密称取0.2368g，置500ml量瓶中，加盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，加同一溶剂稀释至刻度，摇匀，在254nm波长处测得吸收度为0.435，按为915计算，求其百分含量。例％＝＝百分含量％4.100%1002368.0500100100915435.0%100WD100%11lEAcm含量测定•对照品比较法:配制供试品溶液和对照品溶液，测定λ处吸收度C待测＝C对照×含量％＝×100％要求浓度与吸光度成正比，因此供试品与对照品溶液中的被测成分应尽可能一致（实际要求±10%）含量测定•标准曲线法（多点对照）绘制对照液浓度－吸光度标准曲线（3-5点）拟合回归方程，求出供试液浓度标准曲线•计算分光光度法多波长校正计算分光光度法双波长分光光度法三波长分光光度法导数光谱法解联立方程法比色法：供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。荧光分析法荧光处于第一激发态的分子，跃迁回基态时发射的光称为荧光，其能量小于激发光，波长长于激发光；除去激发光源，荧光立即熄灭荧光激发光谱（激发光谱）荧光发射光谱（荧光光谱）荧光为发射光，利用荧光的物理特性进行定性与定量测定的方法称为荧光分析法（激发光谱）（发射光谱）原理当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件一定时，在较稀浓度范围内药物的荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比荧光强度∝浓度特点：灵敏度较紫外高、选择性好(10-10～10-12g/mL)；取样少、方法快速；应在低浓度下进行；干扰因素较多，须进行空白校正；能产生荧光的物质较少，可采用荧光衍生化处理含量测定对照品比较法由于绝对荧光强度难以测定，需要在每次测定前用一定浓度的对照品溶液校正仪器灵敏度，然后读取对照品溶液、供试品溶液及各自溶剂的空白读数。C待测＝C对照×由于浓度线性范围较窄，应在0.5～2.0之间色谱分析法是一种分离分析方法利用各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异得到分离，再逐个进行分析介绍两种色谱分析方法：高效液相色谱法（HPLC）气相色谱法（GC）固定相色谱过程流动相被分离组分保留时间——定性进样点t0死时间tR保留时间tR保留时间峰面积（或峰高）——定量色谱的保留行为类型特点HPLCGC分离效能高（理论板数n）104～105填充柱103毛细管柱=106分析速度快几分钟～几十分钟几分钟～几十分钟灵敏度高（最小检出量）UVD10-9gFD10-13gTCD10-8gFID10-13g适用范围宽80%有机化合物20%有机化合物仪器化程度高智能化智能化高效液相色谱法（HPLC）固定相、流动相及检测器的选择常用系统固定相（色谱柱）：十八烷基键合硅胶C18流动相：甲醇-水、乙腈-水检测器：紫外吸收检测器分析型色谱柱各种类型色谱柱色谱柱内径：4.6mm长度：15mm、25mm柱填料粒度：5～10μm检测器紫外检测器（UVD最常用）、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器（DVD）、蒸发光散射检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）等高效液相色谱法（HPLC）系统适用性试验★用规定的对照品对仪器进行试验和调整理论板数（n）分离度（R）重复性（RSD）拖尾因子（T）√√√√1）色谱柱的理论板数（n）n值越大柱效越高，应高于规定的最小理论板数2R)Wt5.54(n21tR保留时间Wh/2半高峰宽2）分离度（R）R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定外，应大于1.5。21)(212WWttRRR3）重复性考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0％。RSD计算公式hW05.0份号12345A20617.2519663.0719543.3020412.4119254.30例题取某对照品溶液10μl，连续进样5次，记录各次色谱峰峰面积如下，试判断色谱系统重复性是否符合规定。X=19898.1S=586.789RSD=2.9%不符合规定—4）拖尾因子（T）考察色谱峰的对称性T值越接近于1.0色谱峰的对称性越好，测量的准确度越高。采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。105.02dWThW0.05h为0.05峰高处的峰宽d1为峰极大至峰前沿之间的距离▲选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。▲校正因子（f）其含义为：内标物峰面积与其浓度之比（As/Cs）是对照品峰面积与其浓度之比（AR/CR）的多少倍。f=As/CsAR/CR含量测定•内标加校正因子法：对照+内标样品+内标样品内标对照内标C样=f·A样/(A’内/C’内)校正因子f=(A内/C内)/(A对/C对)•外标法：（1）外标一点法被测成分与其峰面积成正比关系要求供试液与对照液浓度相近=A供A对C供Ｃ对样品C供=C对×A供A对对照•外标法：（2）标准曲线法绘制浓度－峰面积(峰高)标准曲线；拟合回归方程并计算拟合常数；测定供试品峰面积(峰高)，带入方程，求出浓度。特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。基本原理各组分在固定相与载气之间由于分配系数不同而按不同顺序被带出，分配系数小的组分先流出，分配系数大的后流出以气体为流动相的色谱法气相色谱法（GC）优点灵敏度高、样品用量少分离效能高，分离速度快缺点受样品蒸气压的限制不适于难气化和热稳定的药物色谱柱、载气及检测器的选择气源进样及气化系统色谱柱和柱温箱检测器热导检测器氢火焰离子化检测器电子捕获