酶免疫分析技术

第七章酶免疫分析技术目录概述1酶联免疫吸附试验2酶联免疫吸附试验的应用和注意事项3其他酶标记免疫测定技术4返回总目录第七章酶免疫分析技术2酶免疫分析技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定第七章酶免疫分析技术第一节概述一、基本原理酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体(抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作用于底物的显色反应来判定结果。第七章酶免疫分析技术二、酶和酶底物标记酶的要求：①活性高，纯度高②作用专一性强③性质稳定，易与抗原或抗体偶联④测定方法简便易行、敏感、精确⑤酶和底物对人体无害⑥酶和底物价廉易得第七章酶免疫分析技术（一）辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）2.糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶第七章酶免疫分析技术DH2十H2O2—D十2H20HRP催化的反应式为：DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。第七章酶免疫分析技术邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTSHRP常用底物第七章酶免疫分析技术OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。第七章酶免疫分析技术（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取AP的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。第七章酶免疫分析技术（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。β-Gal的底物4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。第七章酶免疫分析技术（四）其他酶在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。第七章酶免疫分析技术三、酶标抗体(抗原)的制备制备要求：抗原要求纯度高、抗原性强。抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。第七章酶免疫分析技术（一）常用的标记方法标记方法要求：①方法简单，产率高②不影响酶和抗体(抗原)的生物活性③所得酶结合物稳定，本身不发生聚合④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的聚合物第七章酶免疫分析技术1．过碘酸钠氧化法仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。第七章酶免疫分析技术2．戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。第七章酶免疫分析技术（二）酶标记物的纯化与鉴定1．酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。第七章酶免疫分析技术2.酶标记物的鉴定（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。第七章酶免疫分析技术四、固相载体（一）固相载体的要求①结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定；②可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲和素等大分子；③固相化后分子仍应保持活性；④固相化方法应简便、快速。第七章酶免疫分析技术（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2．微颗粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.微孔虑膜是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。第七章酶免疫分析技术微量反应板返回章目录第七章酶免疫分析技术第二节酶联免疫吸附试验一、基本原理将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。第七章酶免疫分析技术二、酶联免疫吸附试验的类型（一）双抗体夹心法检测抗原将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。1.原理第七章酶免疫分析技术E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法检测抗原第七章酶免疫分析技术（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2．技术要点第七章酶免疫分析技术（+）（-）EEEEEEEEE双抗体夹心法测抗原第七章酶免疫分析技术双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。3．注意事项第七章酶免疫分析技术（二）双位点一步法检测抗原即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。1．原理第七章酶免疫分析技术EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体双位点一步法检测抗原第七章酶免疫分析技术EEEE（+）EE（-）双位点一步法测抗原第七章酶免疫分析技术如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。2．注意事项第七章酶免疫分析技术（三）竞争法检测抗原酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。1．原理第七章酶免疫分析技术酶标抗原EEEE固相抗体标本（含抗原）底物E竞争法检测抗原第七章酶免疫分析技术（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。2．技术要点第七章酶免疫分析技术（+）EE（-）EEEEEEEE竞争法测抗原第七章酶免疫分析技术（四）间接法检测抗体将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。1．原理第七章酶免疫分析技术固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法检测抗体第七章酶免疫分析技术（1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。（2）加稀释的受检血清，洗涤。（3）加酶标二抗，洗涤。（4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体的量。2．技术要点第七章酶免疫分析技术（+）EEEEEE（-）EEE间接法测抗体第七章酶免疫分析技术（五）双抗原夹心法检测抗体将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。1．原理2．技术要点第七章酶免疫分析技术E固相抗体标本（含抗体）酶标抗原底物EE双抗原夹心法检测抗体第七章酶免疫分析技术（+）（-）EEEEEEEEE双抗原夹心法测抗体第七章酶免疫分析技术（六）竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。1．原理第七章酶免疫分析技术（1）竞争法检测HBcAb：①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。2．技术要点第七章酶免疫分析技术固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测HBcAb第七章酶免疫分析技术（+）EE（-）EEEEEEE竞争法检测HBcAb第七章酶免疫分析技术（2）竞争法检测HBeAb：①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。第七章酶免疫分析技术固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测HBeAb第七章酶免疫分析技术（+）（-）EEEEEEEEE竞争法检测HBeAb第七章酶免疫分析技术（七）捕获法检测抗体将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。1．原理第七章酶免疫分析技术（1）将抗人IgMμ链抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加人待检标本，温育，洗涤。（3）加入特异性抗原，温育，洗涤。（4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。（5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标比色仪测定结果。2．技术要点第七章酶免疫分析技术固相抗人lgM抗体E标本（含抗体）抗原底物EE固相捕获法检测lgM抗体第七章酶免疫分析技术EEEEEE（+）（-）捕获法第七章酶免疫分析技术采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。3．注意事项第七章酶免疫分析技术非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。第七章酶免疫分析技术三、最适工作浓度的选择（一）间接法检测抗体（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，温育，洗涤。（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。1．酶标抗抗体工作浓度的选择第七章酶免疫分析技术（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗涤。（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育，洗涤。2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度第七章酶免疫分析技术（4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。第七章酶