第11章 抗生素类药物的分析

1第十一章抗生素类药物的分析AnalysisofAntibioticsDrug2本章主要内容：第一节概述第二节β–内酰胺类抗生素第三节氨基糖苷类抗生素第四节四环素类抗生素3本章学习目标：1.熟悉抗生素类药物分析的特点及其常规检验项目。2.掌握β－内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类抗生素的结构、性质、鉴别及含量测定。3.了解抗生素类药物的质量考察方法4第一节概述1.抗生素的定义抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，在低微浓度下即可对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。52.抗生素的来源（1）生物合成（发酵）（2）化学合成或半合成63.抗生素质量的复杂性产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂7发酵液中杂质:无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌[检查]84.含量测定方法（1）生物学方法测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大9（2）化学及物理化学方法以理化方法测定主药含量优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰10•抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。•用单位（u）或微克（ug）表示。•如：1mg青霉素纳定为1670单位。（1670u/mg）（3）抗生素活性表示方法115.分类（按结构与性质）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类12NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第二节β–内酰胺类抗生素青霉素类13头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO14CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素（青霉素G、苄青霉素）15NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林（氨苄青霉素）16阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH217C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素18头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH219头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO20NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性结构与性质一、Na与碱金属(Na+、K+)成盐（一）羧基易溶于水21与有机碱(普鲁卡因)成盐难溶于水普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH222NSO1234567（二）手性C87654321NOS(5%头孢唑啉钠溶液–18～–24°)20D］［头孢菌素类C6C7青霉素类C2C5C6旋光性﹡﹡﹡﹡﹡23（三）共轭体系NSO头孢菌素类母核有共轭体系青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基NOSUV24（四）β–内酰胺环水溶液不稳定干燥纯净稳定不稳定性因素四元环张力大酰胺键易水解25（某些金属离子）（温度）失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶某些氧化剂26例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl227失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶28二、K+、Na+反应（一）鉴别实验焰色→鲜黄色Na+焰色→紫色K+29（二）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOHHClNOHH内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+/3H+30NSONSCOHNHOHH2NOHHClNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3（红、棕、褐）31（1）双缩脲反应β-内酰胺类CONH紫内酰胺类碱性酒石酸铜（开环分解）似肽键2.类似肽键的反应32NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2(2)茚三酮反应蓝紫色氨基茚三酮△α-氨基332OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH蓝紫色34(1)与变色酸-硫酸反应活泼“-CH-”青霉素阿莫西林氨苄西林HCHOCHSOH42”羰基侧链含“△（分解）变色酸显色3.其他呈色反应35NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2变色酸阿莫西林HCHOSOH150℃（缩合）色褐36SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）37(2)与重氮苯磺酸反应橙黄色重氮苯磺酸OHHC（偶合）酚羟基头孢哌酮38光谱法（三）1、UV法A,Emin,max,,%1cm1光谱图样品、分解产物nm339HA苯唑青霉烯酸苯唑青霉素Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.5039NOCONHCH3NOSCH3CH3COONaNOCHCH3OCOCNHNCHHCCH3CH3SHCHCOOHCu2+pH3.8△40412、IR法117401815cm~VOC116901710cm~VOCβ-内酰胺环酰胺42色谱法（四）1、TLC法对照品对照法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR2、HPLC法Rt比较供试品对照品相同条件43三、特殊杂质的检查•（一）高分子聚合物（分子排阻色谱法）•（二）有关物质和异构体（色谱法）•（三）吸光度•（四）有机溶剂（GC法）•（五）结晶性（偏光显微镜法、X射线粉末衍射法）44HPLC法ChP头孢菌素类内标法＋校正因子外标法特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）四、含量测定45哌拉西宁原料药含量测定色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇–0.2mol/L磷酸二氢钠溶液–10％氢氧化四乙基铵溶液–水（400︰50︰3︰547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。46第三节氨基糖苷类抗生素苷苷元糖缩合氨基糖苷苷元氨基糖缩合链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素47链霉素链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺苷元糖链霉双糖胺48NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺49NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺50庆大霉素糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺糖51ROCR1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺52ROCR1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺53一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）（三）旋光性含有多个氨基糖54链霉素硫酸盐pH5～7.5庆大霉素硫酸盐pH2～12稳定UV（四）稳定性（五）链霉素水解（六）链霉素最大吸收波长为320nm。链霉胍、链霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺55二、鉴别实验茚三酮反应（一）蓝紫色庆大霉素链霉素茚三酮△羟基胺结构56N-甲基葡萄糖胺反应（二）甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）57麦芽酚反应（三）链霉糖特有反应链霉糖链霉素OH麦芽酚紫红色3FeH+分子重排58NHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2ONaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红麦芽酚59链霉胍特有反应橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠8OH（或α-萘酚）NOH8-羟基喹啉坂口反应（四）α-萘酚OH60（五）24SO反应白BaSOSOBaH+UV法（六）IR法（七）庆大霉素无UV吸收nmmax链霉素TLC法（八）61三、杂质检查链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）2.方法TLC中的对照品法（BP）1.来源反应中间体62对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分的测定（二）63.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理1.641-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物RNH2++HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOH65RP－HPLC方法2.规定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%计算3.%AAAAA%ACCCCiiaa峰面积归一化法6667如：血清中庆大霉素的HPLC法•血浆样品的预处理；•离子对色谱法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干扰；•选用邻苯二醛（OPA）为荧光衍生化试剂。68四、含量测定链霉素、庆大霉素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。692CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1第四节四环素类抗生素ABCD702CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1123456789101112712CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO四环素（TC）tetracycline722CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOCl金霉素(CTC)chlortetracycline氯四环素732CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOOH土霉素(OTC)oxytetracycline氧四环素742CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3OH多西环素(DOTC)doxycycline脱氧土霉素75美他环素（METC）metacyclineHOHCONH2OOHOHOOHNCH32OHCH2762CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R177一、结构与性质两性（一）1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑酚羟基、烯醇型羟基弱酸性二甲胺基弱碱性3.吸湿性多含结晶水78与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+UV和荧光性质（三）与金属离子络合（四）pH3~7.5荧光旋光性（二）79HOHOCaOOOOHOHOO80不稳定性（五）1.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～pH淡黄→黑蓝色荧光81OHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHO差向四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO822CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（土霉素、多西环素不易差向异构化）832.降解反应（1）酸性下降解脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜pHλmax=445nmλmax=435nm橙黄色842CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HONCH32HOHCONH2OOHOOHCH3OH脱水四环素852CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOpH26～pH26～TCOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOETCNCH32HOHCONH2OOHOOHCH3OHATCN2CH3OHCONH2OOHOHOHOCH3HEATCpH2＜pH2＜86（2）碱性下降解异四环素四环素OH（荧光）HOHCONH2OOHOHOOHC