第11章抗生素类药物的分析2-XXXX

药物分析学（第十六章）抗生素类药物的分析（2）AnalysisofAntibiotics本节教师：韩海（博士/副教授)暨南大学药学院Tel:18620908821E-mail:[e-mail]:560118562013.11.18第三节氨基糖苷类抗生素氨基糖苷碱性环己多元醇苷元氨基糖缩合)(链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素代表药物Aminoglycosids一、化学结构与性质链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺1.链霉素苷元2.巴龙霉素巴龙胺+巴龙二糖胺OOOOHOCH2OHHONH2HOOOHNH2NH2OHOOHR2NH2CH2OH****R1D-葡萄糖胺脱氧链霉胺D核糖巴龙霉糖巴龙胺(苷元)巴龙二糖胺(糖)3.庆大霉素绛红糖胺+2-脱氧链霉胺+加洛糖胺OONH2OHOOOHNHCH3OHCH3NH2NH2R1HN---C----R3***R2*绛红糖胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H主要成分苷元H3HHONH2ONH2OHNH2NNHCH3COOHOOCH3奈替米星（netilmicin）脱氧链霉胺（氨基糖）绛红糖胺（氨基糖）加洛糖胺★理化性质结构相似理化性质相似1.溶解度与碱性碱性:碱性中心链霉素3个庆大霉素5个多与硫酸成盐溶解性:水溶性多羟基化合物易溶于水，不溶于乙醇、氯仿。2个强碱性胍基（PKa=11.5）1个甲胺基（PKa=7.7）2.旋光性结构中氨基糖的手性碳原子.庆大霉素、巴龙霉素等均有旋光性。硫酸庆大霉素121~107][20D硫酸巴龙霉素55~50][20D硫酸卡那霉素110~102][20D50mg/ml水溶液结合较弱结合较强3.苷的水解与稳定性链霉素——pH5～7.5时稳定过酸过碱则水解。庆大霉素、奈替米星——对光、热空气均稳定。水溶液pH2～12时稳定。4.紫外吸收nm230max链霉素庆大霉素、奈替米星等无UV吸收OOHHOOHNHOOOOHOCHOCH3OHCOHNHNHH2NNH2NHNHH3H★★(二)鉴别试验1.茚三酮反应ChP：硫酸庆大霉素、硫酸核糖霉素氨基糖苷结构具有羟基胺类和α—氨基酸的性质蓝紫色庆大霉素链霉素茚三酮△CNH2H+2.Molisch试验五碳糖和六碳糖的特征反应五碳糖氨基糖苷化合物六碳糖氨基糖苷化合物H+浓H2SO4/HClOCHOOCHOHOH2Cα-萘酚/蒽酮红紫色或蓝紫色硫酸核糖霉素0.1%蒽酮/浓H2SO4蓝色→蓝绿色OHOH2CCHOOHOHOH2CCHOHOH红紫色羟甲基糠醛(含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物)OHOH2CCHOoOH2CCHoo蓝紫色OOHOOHHN--C---NH2H2N--C---NHNH*OHCH3CHOOHOOCH2OHOHOH*NH*NHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应★★链霉素水解产物反应N—甲基葡萄糖胺反应(Elson—Morgan反应)甲基葡萄糖胺硫酸巴龙霉素硫酸新霉素链霉素水解N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色NCH3COCH3HHOCH2CHOH3HHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3NNHCH3NHNHNHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNCH3COCH3HHOCH2CHOH3(缩合)323COCHCOCHCHOHOHHHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3N红色对二甲氨基苯甲醛H+NCH3COCH3HHOCH2CHOH3例硫酸新霉素Ch.P（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色。麦芽酚反应——链霉糖特有反应链霉糖链霉素OH分子重排六元环脱N—甲基葡萄糖胺脱链霉胍麦芽酚H+3Fe紫红色硫酸铁铵OOHHOOHNHOOOOHOCHOCH3OHCOHNHNHH2NNH2NHNHH3H/3+3OOCH3OFeH+Fe3+OHOOCH3OH分子重排麦芽酚坂口反应（Sakaguchi反应）链霉胍特有反应橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠8OH（或α-萘酚）加入尿素使颜色稳定可比色测定硫酸链霉素0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1％的8—羟基喹林的乙醇溶液1ml，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。OOHHOOHNHOOOOHOCHOCH3OHCOHNHNHH2NNH2NHNHH3H坂口反应NOOBrNOHBrOOBrRNHCONHNN+BrORNCNNH2OH-硫酸盐反应白4242BaSOSOBaH+TLC法——硫酸链霉素和硫酸庆大霉素鉴别[色谱条件特点]：吸附剂:硅胶展开剂：氯仿—甲醇—浓氨水显色剂：茚三酮或碘蒸气和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fRHPLC法鉴别BP硫酸庆大霉素据色谱图中庆大霉素C1、C2、C1a、C2a的保留时间鉴别。光谱法鉴别1.IR——ChP鉴别妥布霉素USP鉴别硫酸庆大霉素。2.UV——BP硫酸庆大霉素饱和结构240—330nm无吸收例【鉴别】HPLC法Ch.P（2010）硫酸依替米星硫酸卡那霉素硫酸小诺霉素硫酸奈替米星硫酸阿米卡星硫酸庆大霉素硫酸西索米星硫酸巴龙霉素妥布霉素三、特殊杂质检查及组分分析（一）链霉素杂质链霉素B（甘露糖链霉素）活性低来源：反应中间体残留TLC（对照品法）BP（2000）甘露糖链霉素D-甘露糖对照品D-甘露糖水解TLC展开、显色，比较(﹤3.0%)方法：HPLC法(ChP2010)(二)、硫酸奈替米星中的有关物质检查特殊杂质：西梭米星来源：合成原料残留方法：TLC对照品法与高低浓度对照法同时控制杂质限量★(三)、庆大霉素C组分的测定C组分比例不一致发酵菌种不同工艺差别对微生物的活性无明显差异不同的C组分毒副作用和耐药性不同ChPJPBPUSP规定控制各组分的相对百分含量方法：柱前衍生化—离子对HPLC法庆大霉素无UV吸收Gentamycin-NH2+OPA+HSCH2COOH吲哚衍生物4.10pHλmax=330nmNRSCH2COOH1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物RNH2++HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOHλmax=330nmHPLC条件色谱柱：ODS流动相：水—冰醋酸—甲醇(25:5:70)配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液检测波长:330nm计算:峰面积归一化法规定C120~40%C1a10~30%C2a+C2b+C240~60%庆大霉素C组分的测定实验条件的讨论1、OPA的作用是什么？2、冰醋酸的作用是什么？3、庚烷磺酸钠的作用是什么？NRSCH2COOHOONH2OHOOOHNHCH3OHCH3NH2NH2R1HN---C----R3***R2*绛红糖胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺（四）硫酸盐测定Cl2BaSOBaClSO4224定量过量NaCl2BaEDTANa2EDTABaCl2剩余剩余滴定法NaCl2BaEDTANa2EDTABaCl2定量过量空白滴定四、含量测定1.免疫分析法2.微生物检定法（各国药典普遍采用）利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。3.HPLC法优点:高灵敏度、专属性广泛应用于抗生素稳定性研究及体内分析氨基糖苷类一般无吸收柱前(后)衍生化【含量测定】Ch.P规定方法微生物检定法盐酸大观霉素，硫酸新霉素，硫酸链霉素，硫酸核糖霉素，硫酸奈替米星，硫酸阿米卡星，硫酸庆大霉素，硫酸西索米星，硫酸巴龙霉素，硫酸小诺霉素HPLC法硫酸依替米星，硫酸卡那霉素生物样品中氨基糖苷类分析的原则1、OPA、FMOC-Cl、FDNB柱前衍生化反应重要意义：2、样品预处理：（1）离子对试剂（2）固相萃取柱3、柱前衍生化反应是否完全需要考查第四节四环素类抗生素结构上具有氢化骈四苯环，统称为四环素族抗生素一、基本结构与化学性质化学结构:四骈苯或萘骈萘的衍生物。取代基不同而构成不同的四环素.nameRR’R’’R’’’四环素TCHOHCH3H金霉素CTCClOHCH3H土霉素OTCHOHCH3OH脱氧土霉素DOTCHHCH3OHOHOHNH2OOOOHOHCH3NHHCH3CH3HHOH多西环素（DOTC）（doxycycline）（脱氧土霉素）（强力霉素）A环B环C环D环二甲氨基—N(CH3)2酚羟基酰胺基—CONH2酮基与烯醇基共轭双键系统酮基与烯醇基共轭双键系统★结构特点与分析方法之间的关系1.共轭双键，刚性结构：具有紫外吸收，可产生荧光，可进行鉴别和含量测定。2．具有酚羟基、烯醇基：可发生三氯化铁反应、可与金属离子络合，用于鉴别。3.具有手性碳原子：具旋光性，用于鉴别。理化性质1.酸碱性与溶解度两性:酚羟基、烯醇羟基弱酸性二甲胺基弱碱性1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑3.游离组分在水中溶解度很小溶解度:2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5%加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分2.旋光性——用于鉴别、定量分析ChP—盐酸土霉素：-188°～-200°盐酸四环素：-240°～-258°3.UV吸收和荧光共轭双键系统：具有紫外吸收，可产生荧光降解产物的荧光可供鉴别用。土霉素绿色荧光；金霉素蓝色荧光；四环素黄色荧光H+OH-4.与金属离子形成配位化合物酚羟基、烯醇基的性质。Ca2+Mg2+Fe3+Al3+等pH3~7.5强烈荧光5.不稳定性:水溶液对酸、碱、氧化剂均不稳定。1）差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～4462pH淡黄→黑蓝色荧光土霉素、多西环素不易差向异构化OHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOA环上手性C4构型的改变2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO差向四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（土霉素、多西环素不易差向异构化）多西环素不发生（C环无羟基）（2）碱性下降解异四环素四环素OH（荧光）多西环素不发生2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO～～TCOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOETCNCH32HOHCONH2OOHOOHCH3OHATCN2CH3OHCONH2OOHOHOHOCH3HEATC＜＜差向脱水差向脱水★二、鉴别试验1.浓H2SO4反应黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH2.FeCl3反应酚-OH反应褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeCl氧化、脱水3.TLC法正相分配薄层色谱——对照品法载体：硅藻土（中性）+EDTA展开剂：乙酸乙酯-氯仿-丙酮(2:2:1)+EDTA显色：UV：365nm荧光ChP，BP方法克服痕量金属造成的拖尾现象4.HPLC法ChP，USP方法保留时间鉴别（pH7）盐酸土霉素，盐酸金霉素，盐酸多西环素，盐酸美他环素5.荧光反应：四环素类在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。土霉素金霉素四环素绿色荧光蓝色荧光黄色荧光OHUV绿色荧光H+UV6.UV法溶剂:1mol/L盐酸-甲醇（1→100）浓度:0.01mg/mlnm355268max、盐酸四环素三、特殊杂质检查1.有关物质4-差向四环素（ETC