第13章 生物合成核酸类药物

第13章生物合成核酸类药物核酸类物质药物一般可分为两大类：一类具天然结构的核酸类物质，另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶Ⅱ等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。核酸类物质生产方法有化学合成法、酶解法和发酵法三种。化学合成法生产，工艺比较复杂，设备条件要求较高；酶解法受到酶源及原材料的局限；发酵法以糖质原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低，优势更为明显。主要核酸类发酵产物及其应用13.1肌苷的发酵法生产1．概述肌苷是近年来生产发展较快的一种生化药品，对不同类型的心脏病及肝脏病都有较好疗效，并具有无毒、无副作用的特点。另外，它还是唯一能代替人体内辅酶A功能的药物。肌苷经磷酸酯化后生成5`-肌苷酸，用作鲜味剂的前体物质。主要生产国是日本，试验室产量已达80g/L以上，我国实验室产量30g/L左右，生产水平在20g/L左右。肌苷化学名是次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物，其磷酸酯为肌苷酸。在次黄嘌呤核苷中，核糖连在N-9位置上，以糖苷键的形式连接在以呋喃形式存在的核糖第一位碳原子上，分子式为C10H12N4O5，相对分子质量为268.23。肌苷为白色结晶或呈无水粉末状，无嗅，味微苦，熔点约为218℃，易溶于水，pH近中性。在饱和水溶液中约含肌苷15g/L，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。肌苷的结构式2．生产菌种主要为细菌，如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、谷氨酸小球菌、节杆菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌等。此外，一些酵母和霉菌也可产生肌苷。3．培养基斜面培养基：葡萄糖1.0％、牛肉膏1.4％、蛋白胨1.0％、酵母膏1.0％、氯化钠0.5％，pH7.0~7.2。种子培养基：葡萄糖1.0％、酵母膏1.5%、蛋白胨1.0％、玉米浆0.5％、氯化钠0.5％，pH7.0~7.2。发酵培养基：葡萄糖12％、酵母粉1.4％、硫酸铵1.3％、玉米浆0.5％、尿素0.2%、氯化钾0.6%、磷酸氢二钠0.5％、硫酸镁0.22％、碳酸钙2.0％、pH7.0~7.2。灭菌条件：斜面培养基0.1MPa，20min，种子培养基及发酵培养基0.08MPa，15min。4．生产工艺5．发酵控制碳源大多使用葡萄糖，在发酵生产中也可利用淀粉水解液。常用氮源有氯化铵、硫酸铵或尿素等。因肌苷的合氮量很高(20.9％)，所以须供应足够的氮源，工业发酵常用氨水来调节pH，这样既可以供氮源，又可调节发酵液的pH。磷酸盐对肌苷生成有很大影响。采用短小芽孢杆菌的腺嘌呤缺陷型发酵时，可溶性磷酸盐如磷酸钾显著抑制肌苷累积，不溶性磷酸盐如磷酸钙可促进肌苷的生成。采用产氨短杆菌变异株时，肌苷发酵不需要维持低水平无机磷，即使添加2％磷酸盐，也能累积大量肌苷。肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株，培养基中须加入适量腺嘌呤，如酵母膏等。由于腺嘌呤是肌苷酸的前体，而腺苷酸又是控制IMP生物合成的主要因子，所以加入腺嘌呤的多少，不仅影响菌体的生长，更影响肌苷积累。腺嘌呤对肌苷积累最适浓度比菌体生长所需要的最适浓度小一些，称为亚适量。氨基酸促进肌苷积累、节约腺嘌呤用量。其中组氨酸是必需的，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸等8种氨基酸也有促进作用。除组氨酸外的其他8种氨基酸可以用高浓度的苯丙氨酸一种来代替。氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加。发酵条件，如pH值、温度、通气搅拌等都是影响肌苷积累的重要因素。肌苷积累的最适pH值为6.0~6.2；最适温度对枯草杆菌为30℃，对短小芽孢杆菌为32℃；供氧不足可使肌苷生成受到显著的抑制，而积累一些副产物；通气搅拌可减少CO2对肌苷发酵的抑制作用。6．肌苷的生理作用和药用价值肌苷可直接透过细胞膜，进入人体细胞内，使处于低能缺氧状态下的细胞恢复正常水平，继续进行新陈代谢，并能活化丙酮酸氧化酶类，参与人体细胞蛋白质的合成，具有激活细胞、刺激代谢等作用。当细胞内ATP含量显著或持续下降时，细胞功能低下，此时细胞进入低能状态，ATP的加入可以解除这种低能状态。但ATP不能透过细胞膜，而肌苷对细胞有高度的渗透性，因此，肌苷是唯一代替人体增加ATP的药物。肌苷进入细胞后生成丙酮酸，丙酮酸可转化为辅酶A和乳酸。肌苷主要应用于心脏疾病、肝脏病、白细胞减少症、放射性照射病、贫血病、血吸虫病、视网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。肌苷可制成肌苷二醛、异丙肌，对精巢上皮瘤、麦粒细胞癌以及某些病毒性疾患都可以起缓解或抵抗作用，还可制造干扰素的诱导剂。此外，肌苷磷酸化后生成肌苷酸，是制造强力味精的前体物质。13.2肌苷酸的生产肌苷酸由核糖、磷酸和次黄嘌呤组成，其中磷酸结合在核酸的第5位羟基上。肌苷酸的结构式肌苷酸为白色结晶粉末状或颗粒状，味鲜，无臭，易溶于水，在乙醇或其他有机溶剂中溶解度极小。核苷和碱基容易透过细胞膜而核苷酸却难以透过，因此由微生物直接发酵法生产肌苷酸比较困难。可解除微生物自身反馈调节、改变细胞膜通透性，在发酵液中积累肌苷酸。发酵法得到的是肌苷酸钠盐。1．生产菌种有短小芽孢杆菌、产氨短杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、某些链霉菌等。肌苷酸产生菌在Mn2+限量(20µg/L以下)的条件下，菌体会产生膨胀异常形态，积累肌苷酸，因此认为细胞膜对肌苷酸存在透过性障碍。Mn2+使细胞通透性降低。2．肌苷酸生物合成途径最初起作用的酶是PRPP氨基转移酶，该酶受AMP、ATP及GMP的反馈抑制，被腺嘌呤阻遏。还有腺苷酸琥珀脱氢酶（SAMP脱氢酶）和GMP还原酶。诱变处理可获得SAMP脱氢酶缺失的腺嘌呤缺陷型突变株和缺失XMP氨化酶的鸟嘌呤缺陷型菌株更多地积累肌苷酸。肌苷酸合成途径3．肌苷酸的生产工艺肌苷酸的生产方法（1）将生物细胞内的呈味核苷酸用化学方法抽提和精制。（2）从微生物（例如酵母）细胞提取核酸后，再通过有关酶系进行核酸降解。（3）用发酵法或合成工艺制得肌苷酸的前体物质，再经微生物转化而成。（4）选育肌苷酸高产变异菌株，直接发酵生产。一般采用方法（2）和方法（4）生产肌酸。国外采用枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌的营养缺陷型、抗代谢类似物、Mn2+不敏感抗生物素菌株，以糖类等为基质的发酵法得到稳步发展，效益显著。工艺路线如下：试管斜面培养→摇瓶种子培养→二级种子罐培养→三级种子罐培养→发酵→板框压滤→脱色→活性炭吸附→浓缩结晶→精制4．肌苷酸的用途肌苷酸可参与机体能量代谢以及蛋白质合成，活化丙酮酸氧化酶，能使细胞在缺氧状态下继续进行代谢。肌苷酸的主要医用价值为白细胞或血小扳减少症、各种急慢性肝炎、肺原性心脏病、中心性视网膜炎、视神经萎缩症、放射线照射病、毛地黄中毒症以及血吸虫病等的治疗。肌苷酸更主要用途是作为助鲜剂，制成强力味精(第二代味精)和复合调味料(第三代味精)。肌苷酸单独存在时，鲜味并不显著，但与谷氨酸钠(味精)并存时，该混合物鲜味随肌苷酸含量的增加而增强。此外肌苷酸可提高酱油品质。13.3鸟苷酸的生产鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成，磷酸结合在核糖的5`位羟基上，又名5`-单磷酸鸟苷，分子式为C10H12N5O6P。鸟苷酸的结构式鸟苷酸为白色晶体或粉末，溶于冷水中，能完全溶于碱溶液中，在冷的酸性溶液中缓慢分解。生产中多以钠盐形式出现。鸟苷酸在菌体内的浓度超过一定限度，就会引起反馈调节，抑制鸟苷酸合成。尤其是使PRPP转酰胺酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶等受到抑制。而且微生物中还普遍存在催化由GMP向乌鸟苷、鸟嘌呤降解的酶系。因此必须利用相关营养缺陷型进行发酵生产。鸟苷溶解度很低，发酵中容易析出结晶，减弱了反馈调节的效果，有可能积累鸟苷。GMP生产方法除RNA分解外，还有：（1）生物和化学合成并用：利用微生物发酵法生产AICAR（S），然后AICAR(S)经过有机化学合成的方法制成GMP。（2）利用细菌发酵生产鸟苷，然后以酶法或化学合成法将鸟苷进行磷酸化，得到GMP。（3）双菌混合发酵：利用XMP或黄苷生产菌与能将XMP或黄苷转化为GMP的菌株混合培养法。（4）利用直接发酵法生产GMP。目前，国内外多采用酵母提取核酸后进行酶解生产鸟苷酸。5`-鸟苷酸有助鲜作用，与适量谷氨酸钠按不同比例混合时，其鲜昧更优于5`-肌苷酸。在特鲜酱油方面也重要应用。在医疗方面，其钠盐用于治疗白细胞减少、血小板下降及肝炎等。