第19章 生物技术药物制剂

第十九章生物技术药物制剂第一节概述一、生物技术的基本概念生物技术或称生物工程（biotechnology），是应用生物体（包括微生物、动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。生物技术药物是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，也称为生物技术药物。近十几年来，生物技术在医药方面取得了惊人的成就，已有不少生物技术药物应用于临床，下面介绍一些国内外已批准上市或正在研究的生物技术药物产品。二、生物技术药物的研究概况生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40余种，见表19-1，正在研究的有数百种之多，部分正在研究的生物技术或其他来源的药物列于表19-2中，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。表19-1已批准上市的生物技术药物产品药品名称用途批准时间人胰岛素糖尿病治疗药1982人生长激素（hGH）治疗侏儒症1985α-2b干扰素治疗毛细胞白血病、乙型肝炎1986OKT3单抗（小鼠抗T细胞单抗）急性肝移植排斥反应1986乙肝疫苗预防乙型肝炎1986组织溶纤酶原激活素急性心肌梗死1987人促红细胞生成素（EPO）慢性肾衰贫血1987Γ-lb干扰素慢性肉芽肿疾病1990GM-集落刺激因子（GM-CSF）骨髓移植中性、白细胞减少症1991G-集落刺激因子（G-CSF）肿瘤化学辅助治疗、白血病、艾滋病1991白细胞介素-2肾细胞癌1992凝血VIII因子血友病1992人肿瘤坏死因子突变体肺、胃、结肠肿瘤1995幼畜腹泻疫苗预防仔猪腹泻上市α-n3干扰素生殖器疣1989小鼠抗CD3抗体肾移植排斥反应1986单克隆抗体（诊断剂）结肠、直肠、卵巢癌诊断1992重组DNA酶α囊性纤维变性，改进胸功能1994抗血小板凝聚单克隆抗体防动脉突然关闭高危性血管成形术病人1995重组葡糖脑苷脂-米葡糖脑酶戈谢病（各器官积聚葡糖脑苷脂）1994重组β-16干扰素缓解上皮癌、肾癌、多发性骨髓瘤1993环孢素A抑制T淋巴细胞功能1996降钙素治疗骨质疏松1996重组γ-干扰素免疫功能障碍、癌症、感染性疾病1992奥曲肽（octreotide）胃肠胰内分泌肿瘤、消化性溃疡出血、肢端肥大症、垂体瘤、柯兴氏综合症、糖尿病等1998*grlanulocyte／macrophagecolony—stimulatingfactor（GM—CSF），粒-巨噬细胞集落刺激因子表19-2部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物药物作用与用途血管紧张素D抑制剂降压心房肽激素（atriopeptins）调节心血管功能降钙素基因相关因子血管舒张药Β-内啡肽镇痛神经生长因子，hNGF刺激神经生长和修复，痴呆促胃液素抑制剂减少胃酸分泌脑啡肽刺激淋巴细胞母细胞化促胸腺生成素选择性T细胞分化激素肿瘤坏死因子控制多形核细胞功能表皮生长因子，hNGF促进表皮生长，痴呆生长抑素（somatostatix）抑制胃液素分泌促性腺素促进排卵、精子生成促黄体生成素释放激素（LHRH）促进下丘脑性闭经妇女排卵催产素促进分娩促甲状腺素释放激素（TRH）延长哺乳期妇女的不育和泌乳加压素治疗尿崩症人尿激酶原溶血栓，抗凝剂人超氧化物歧化酶肾移植，烧伤白细胞介素-6肿瘤、骨髓移植，刺激造血白细胞介素-11促血小板生成链激酶，LSK溶血栓人成纤维细胞生长因子神经损伤人胰岛素生长因子侏儒症肝细胞生长因子重型肝炎肝癌单克隆抗体肝癌乙肝单克隆抗体乙肝反义寡聚核苷酸HIV感染和艾滋病TK载体产生细胞脑癌巨核细胞与发育因子刺激血小板生成脂质体包被IL-2，OTX-287肿瘤抗CD20基因工程抗体B细胞淋巴瘤表19-2中所列药物，如环孢素A（cyclosporinA）、降钙素（calcitonin）、促黄体生成素释放激素（luteinizinghormonereleasehormone，LHRH）类似物、催产素、加压素等，用提取或其他方法生产，已在临床上使用。随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带来了新的挑战。由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性质很不稳定，极易变质，因此如何将这类药物制成安全、有效、稳定的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。例如降钙素基因相关肽是治疗高血压的有效药物，但该药物很不稳定，虽然早已开发，但由于存在以上问题，至今未形成产品。另一方面这类药物对酶敏感又不易穿透胃肠粘膜，故只能注射给药，使用很不方便。因此，运用制剂手段将这类药物制成口服制剂或通过其他途径给药，以提高其稳定性和患者使用的顺应性，是一项非常有意义的工作，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景。三、生物技术药物的结构特点与理化性质生物技术药物多为多肽类及蛋白质类药物，这些药物的化学结构相当复杂，理化性质也有它的特殊性，因此在设计与评价这类药物的给药系统时必须首先了解其结构特性与理化性质。（一）蛋白质的结构特点1．蛋白质的组成和一般结构蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质分子量很大，一般在5×103~5×106。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等。组成蛋白质的氨基酸有20多种，一个氨基酸的羧基可以和另一个氨基酸的氨基缩合失去1分子水而生成肽，两个氨基酸缩合成的肽称为二肽，由十个以上氨基酸组成的肽称多肽。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。蛋白质多肽链中许多氨基酸按一定的顺序排列，每种蛋白质都有特定的氨基酸排列顺序。蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构。一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置；二、三、四级结构为高级结构或空间结构。高级结构和二硫键对蛋白质的生物活性有重要影响。2．蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构包括二级、三级与四级结构。二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有螺旋结构与折叠形式。三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合方式系一条多肽链中所有原子的空间排布。四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质。四级结构可以由两个以上的小亚基聚合而成。所谓亚基，就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价键相联，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位（亚基）。蛋白质高级结构见图19-1。图19-1蛋白质高级结构示意图蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation）时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力（hydrophobicforce）、离子键、范德华力、二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。蛋白质分子二级结构中螺旋、折叠的形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。疏水作用力也称疏水键，疏水键是两个疏水基图19-1蛋白质高级结构见药剂学第4版图20-2为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构方面起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。范德华力对稳定和维持三级、四级结构十分重要。离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸成分通过配位键组成。（二）蛋白质的理化性质1．蛋白质的一般理化性质蛋白质的分子量，小的有几千，如胰岛素（单体6000）；大的上千万，如斑纹病毒（烟草）（6107）。蛋白质在水中形成亲水胶体，颗粒大小在lnm~100nm之间。它不能透过半透膜。由于蛋白质分子中存在极性基团如-NH3+、-COO-、-NH2、-OH、-SH等，可形成水化层而稳定。（1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。（2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。（3）蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。2．蛋白质的不稳定性蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要。引起蛋白质不稳定的原因很多，如前所述，共价键与非共价键的破坏与生成，均可引起蛋白质类药物的不稳定。（1）由于共价键引起的不稳定性：共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。有时几种反应同时进行。虽然大多数降解过程在升高温度时发生，但是蛋白质稳定性监测数据表明其降解过程不符合Arrhenius关系，故蛋白质类药物稳定性的加速实验中应慎重选择其最高温度。如白细胞介素-lβ（interleukin-1β）在溶液中高于和低于39℃时存在不同的失活机制，此实例排除了从加速温度数据预测处方有效期的可能性。但文献报道组织溶纤酶原激活素（tissueplasminogenactivator）在40℃和40℃以下的稳定性研究中成功地将数据外推到5℃。蛋白质的降解途径有：1）蛋白质的水解：蛋白质可被酸、碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐渐变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解与不完全水解。完全水解是在5.7mol／L盐酸中，于110℃高温20h可完全变成氨基酸。在此条件下，能使色氨酸破坏，谷氨酰胺变为谷氨酸，天冬酰胺变为天冬氨酸，后二者的水解作用也叫脱酰胺作用（deamidation）。酸水解可使胱氨酸变成半胱氨酸，丝氨酸、苏氨酸也有不同程度的破坏。不完全水解是在酶或稀酸等较温和的条件下进行，水解产物有肽段与氨基酸。蛋白质在4.2mol/LnaOH溶液中水解10h，使蛋白质完全水解，碱水解对半脱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等有破坏作用，同时使各种氨基酸发生消旋。2）蛋白质的氧化：蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸可以在一些氧化剂的作用下氧化，甲硫氨酸可氧化成甲硫氨酸亚砜而使一些多肽类激素和蛋白质失去活性。半胱氨酸的巯基根据不同的反应条件，可依次氧化为次磺酸（RSOH）、二硫化物（RSSH）、亚磺酸（RSO2H），最后成磺酸（RSO3H）、半胱氨酸，即半胱磺酸。影响氧化的因素有温度、pH值、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度等。巯基的氧化在碱性条件下，特别是在金属离子（如Cu2+）的存在下容易发生。3）外消旋作用（racemization）：某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50％的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH值、离子强度和金属离子螯合作用。蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式（nonmetabolizableforms）。4）二硫键断裂及其交换：二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键。它是由两个半胱氨酸侧链上的-SH巯基脱氢相连而成。二硫键把同一肽链（肽链内）或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。在某些蛋白质中，二硫键一旦