引物设计及测序结果分析

（primerdesign）3.1引物设计引物的定义引物（primer）是一段短的单链DNA或RNA片段，可结合在DNA模板链上与之互补的区域，作为DNA复制的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)、测序和探针合成等。引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功。DNA模板95℃（解链）60℃（退火）与引物结合72℃（延伸）DNA单链Taq酶，dNTPs,Mg2+ForwardprimerReverseprimerPCR的基本原理三步循环：变性、退火、延伸􀂾1.变性：双链DNA解链成为单链DNA􀂾2.退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链GTGATGTTCCTGACGGTACTCTAAAGTCACCGTGGACGGACC535CACTACAAGGACTGCCATGAGTAAAGTCACCGTGGACGGACC5Reverseprimer/anti-senseprimer:5CCAGGCAGGTGCCACTGAAATForwardprimer/senseprimer:5CACTACAAGGACTGCCATGAGCACTACAAGGACTGCCATGAGATTTCAGTGGCACCTGCCTGG53PCRRrimersMⅡ500bp700bp900bp1200bp616365NC100bp300bp琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（1）5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtcatgtacag···5′编码链(CDS)模板链mRNA5′···GCAGUACAUGUC···3′转录N······Ala·Val·His·Val······C蛋白质翻译DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系反转录CDS（codingsequence）是编码一段蛋白产物的DNA序列。一般以ATG开始，以TAA、TAG、TGA结尾。cDNA（complementaryDNA）是与RNA链碱基互补的单链DNA，或此DNA链与其碱基互补的DNA链所形成的DNA双链。PCR模板:cDNA一、引物设计流程序列查找和下载序列同源性比较引物设计与筛选引物的评价分析引物的二次筛选引物的最终评估引物加工与修饰二、引物设计原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体(dimer)或发夹结构(hairpin)引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)（一）基本原则1、引物的长度一般15～30bp，常用18～24bp。引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCR延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶。（二）一般原则2、引物扩增跨度即产物长度，以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3、引物的特异性在模板cDNA的保守区内设计引物。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物3＇端的碱基分布引物3＇端最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对引物3＇端最好以C或G结尾，避免使用A引物3＇端避免出现3个以上连续的C或G,如GGG或CCC引物3＇端5个碱基G+C不宜超过3个4、引物的碱基分布∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。3‘端∆G值应较低，否则易引起错配。5、引物的ΔG值hairpin6、引物的互补情况引物自身及引物之间不宜存在互补序列。如果引物自身折叠成发夹结构（Hairpin），会因空间位阻而影响引物与模板的结合。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5Kcal/mol）,易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度,使PCR反应不能正常进行。Forwardprimer:5AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC33CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA5Forwardprimer:5AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC33CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA5引物自身形成二聚体（self-dimer）上下游引物之间二聚体（crossdimer）Reverseprimer:5CTGTGCTCTCTCATCATCATATTCForwardprimer:3CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAAGillMⅡ5759616365Kindey5759616365NC900bp700bpTargetsegment:813bp琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（2）←dimer7、引物的GC含量G+C含量以40-60%为宜。G+C太少，PCR扩增效果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。8、引物的Tm合理的退火温度为55～70℃两引物的Tm值相差不应大于5℃Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)退火温度=Tm值-5℃9、引物的修饰情况引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物5′端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。在计算Tm值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结构时要加上它们。常用引物设计软件：PrimerPremier5.0Primer3DNAmanOligo6（引物评估软件）三、引物设计软件（一）序列查找和下载://://=455&to=3511=fasta&from=455&to=3511将查找到的CDS序列以.txt文件保存将查找到的CDS序列以.seq文件保存将查找到的CDS序列以.seq文件保存（二）序列同源性比较1、利用在线的NCBI中的BLAST工具进行比较2、利用DNAman等软件进行多序列比较序列比对参数一般默认序列比对结果（三）引物设计与筛选Loadsequence1、利用PrimerPremier5.0软件设计引物，扩增BPMVCP基因片段。PrimerPremier启动界面PressOK导入已知的BPMVCP基因的CDS(codingsequence)序列note：存储的文件路径及名称不能含有中文。序列导入结果显示窗口在目的序列的第一个碱基处双击Genbank窗口点击“primer”按钮点击“search”按钮引物搜索选项设定Press“OK”搜索结果Press“OK”点击选中一对引物搜索结果窗口引物设计窗口挪开“SearchResults”窗口引物数据的保存引物数据库窗口1.按“Ctrl”，选择引物2.点击“Export”3.引物已输入到数据库中引物合成订单选择引物，点击菜单栏“Function”→“orderform”→“newform”,弹出“Synthesisorderform”窗口考核操作题（一）自行在NCBI核酸数据库内检索一个基因CDS序列(长度大于500bp)，完成下列操作（10分）。①将查找到的CDS序列以“基因登陆号.txt”文件保存②设计一对引物扩增此基因片段，要求在搜索标准窗口设置PCR扩增产物长度为200～500bp。③新建一个word文档，报告引物搜索结果的第1#引物及扩增基因长度，附上引物设计窗口和引物数据库窗口图。