第四章 超薄切片技术

生物电子显微技术第四章超薄切片技术生物电子显微技术一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超薄切片技术概述第一节基本概念三、扫描电镜样品制备技术生物电子显微技术一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度又取决于样品制备技术1、决定电镜图像分辨率的两个因素2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理3）样品厚度要适宜4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构生物电子显微技术二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术生物电子显微技术1、表面镀金（喷镀）技术2、组织导电技术3、冷冻断裂技术4、离子蚀刻技术5、临界点干燥技术6、冷冻干燥技术7、铸型观察技术（复型）注：最基本、最经典的还是超薄切片技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制备技术生物电子显微技术四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片为～石蜡切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM专用，一般500～700Å2、制作超薄切片的必要性1).增加电子透射能力2).电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3).减少色差4).减少样品对电子的吸收生物电子显微技术⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀3、对超薄切片的要求生物电子显微技术取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄切片制备的一般程序：生物电子显微技术第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四渗透与包埋五超薄切片六电子染色生物电子显微技术操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4⑶冷：0～4℃⑷准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压一、取材1、含义指从生物体上取下要观察的组织块。2、取材操作规则注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶生物电子显微技术⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材生物电子显微技术1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法•化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛•物理方法：冷冻，干燥，高温二、固定（一）固定的基本知识生物电子显微技术⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差3、固定的目的生物电子显微技术4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集生物电子显微技术1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型⑸提供一定的电子反差5、固定液的作用生物电子显微技术1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件生物电子显微技术优点：⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)生物电子显微技术锇酸缺点：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小⑷固定时间不宜过长⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积⑹有挥发性、剧毒生物电子显微技术2）戊二醛（C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较强的亲和力⑶可长时间固定（7天），适于野外取材⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有刺激性生物电子显微技术戊二醛缺点：⑴不保存脂肪⑵无电子染色作用⑶对缓冲液的要求严格很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛脂类核蛋白蛋白质固定剂不强有小很差强无大较好对BS的选择性电子染色渗透核酸四氧化锇与戊二醛的固定作用比较锇酸戊二醛固定剂生物电子显微技术双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于戊二醛，经济方便4)高锰酸钾（KMnO4)磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结构、叶绿素固定良好。生物电子显微技术1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用⑴维持稳定的pH值⑵提供适当的渗透压⑶提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：»调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）缓冲液和附加剂生物电子显微技术储备A液(0.2M):磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸盐缓冲液4、常用缓冲液生物电子显微技术⑵．巴比妥盐对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存⑶．二钾胂酸盐可长期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制生物电子显微技术⑴单固定：戊二醛或锇酸单次固定1～3小时⑵双固定：前固定（戊），漂洗，后固定（锇）⑶多重固定：用三种以上的固定剂对样品进行固定2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定方式分为：a.浸泡固定b.体外固定c.原位固定d.灌流固定生物电子显微技术固定操作示意图生物电子显微技术漂洗操作方法生物电子显微技术1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2)固定液的渗透压：渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀渗透压高→细胞收缩3)pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.44)固定的温度：0～4℃但低温对细胞微丝、微管有害5)组织块的大小：0.5～1mm36)固定液的用量，一般为组织块的500倍3、固定注意事项：生物电子显微技术三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分的过程。2.脱水的原因：⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；⑵湿样品反差低、必须干燥；⑶含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)生物电子显微技术4.常用的脱水剂：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:⑴脱水要彻底⑵更换液体动作要迅速⑶脱水时间不宜过长⑷固定后的样品要充分漂洗生物电子显微技术附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）脱水前染色：双固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水脱水时染色：脱水至70％乙醇→硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→继续脱水生物电子显微技术四渗透与包埋目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质的超薄切片。步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate)渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充。脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂脱水剂:包埋剂＝3:1→1:1→1:3→纯包埋剂生物电子显微技术渗透时间表(小时）脱水剂：包埋剂动物材料植物材料体外培养细胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。（二）、包埋(embedding)生物电子显微技术1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调节⑵粘度低,易渗透⑶溶于脱水剂⑷电子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低⑹本身无结构⑺热稳定性好,可耐电子束轰击⑻来源丰富，且各批号性能尽可能一致⑼切片易染色,且对人体无害生物电子显微技术2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2)聚酯树脂优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，缺点：不稳定，易脆裂生物电子显微技术3）水溶性包埋剂常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA)注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4)环氧树脂类包埋剂：特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用常用试剂：Epon-812,国产618，ERL－4206Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软MNA（六甲酸酐），块硬生物电子显微技术3.常用配方：⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125mlMNA7ml最终：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多软）冬天：A：B=1：9（B多硬）生物电子显微技术生物电子显微技术（2）国产618配方:61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑剂，苯二甲