透析和超滤

河北大学生命科学学院透析和超滤(DialysisandUltrafiltration)河北大学生命科学学院1．透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜而进行纯化的一种方法。有以下几种方法：脱盐透析：将含盐的生物大分子溶液装入透析袋内。并将袋口扎好放入装有蒸馏水的大容器中，用搅拌方法使蒸馏水不断流动经过一段时间后，透析袋内除大分子外，小分子盐类透过半透膜进入蒸馏水中，使膜内外盐浓度达到平衡。如在透析过程中更换几次大容器中的液体，可以使透析袋内的溶液达到脱盐的目的。脱盐透析是应用最广泛的一种透析方法。透析河北大学生命科学学院平衡透析：也是常用的透析方法之一。方法是将装有生物大分子的透析袋装入盛有一定浓度的盐溶液或缓冲液的大容器中，经过透析，袋内外的盐浓度（或缓冲液pH）一致，从而有控制地改变被透析溶液的盐浓度（或pH）。河北大学生命科学学院反透析：将透析袋放入高浓度吸水性强的多聚物溶液中，透析袋内溶液中的水便迅速被袋外多聚物所吸收，从而达到袋内液体浓缩的目的。这种方法称为“反透析”。可用做反透析的多聚物有聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PolyvinylPyrrolidone,PVP）、右旋糖、蔗糖等。透析用的半透膜很多，玻璃纸、棉胶、动物膜、皮纸等都可用来制作半透膜。河北大学生命科学学院河北大学生命科学学院2．透析膜的种类：可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物(0.1%)、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，用前必须除去。河北大学生命科学学院3．透析袋的处理：方法一：可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。（50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。）方法二：也可用蒸馏水将透析袋煮沸15分钟，用蒸馏水彻底清洗后即可使用。从此时起取用透析袋必须戴手套（或洗干净手）。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，确保透析袋始终浸没在溶液内。用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。河北大学生命科学学院4透析方法：使用时，先检查透析袋是否完好无损？装量：通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。检查透析效果的方法是：用1％BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％AgNO3检查NaCl、KCl等。河北大学生命科学学院超过滤1.超滤法是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法河北大学生命科学学院河北大学生命科学学院离子交换柱层析法分离蛋白质层析技术常用。层析系统包括两个相，一为固定相，一为流动相。当以流动相流过加有样品的固定相时，由于样品各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与流动相之间的分配也不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。河北大学生命科学学院1．按固定相和流动相所处的状态分类：可以分为液相层析和气相层析。2．按层析原理分类：(1)吸附层析(AdsorptionChromatography)(2)分配层析(PartitionChromatography)(3)离子交换层析(IonExchangerChromatography)(4)凝胶层析(GelChromatography)(5)亲和层析(AffinityChromatography)河北大学生命科学学院3．按操作方式不同分类(1)纸层析(PaperChromatography)(2)薄层层析(ThinLayerChromatography)。(3)柱层析(colunmChromatography)河北大学生命科学学院4离子交换柱层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离混合物中各种离子的层析技术。河北大学生命科学学院离子交换剂是由不溶于水的基质和共价结合在基质（母体）上的带电功能基团组成。带电功能基团上还结合有可以移动的、与功能基团带相反电荷的反离子。反离子可以被带同种电荷的其他离子取代而发生可逆的离子交换，这个过程中基质的性质不发生改变。河北大学生命科学学院可分几类：离子交换纤维素：在纤维素分子结构上，连接一定的离子交换基团生成的离子交换纤维素。如DEAE-纤维素(二乙基氨乙基纤维素，-OCH2CH2N+H（C2H5）2)、羧甲基(CM)纤维素河北大学生命科学学院离子交换树脂：以不溶性的人工合成高分子为母体的离子交换树脂，如聚苯乙烯树脂等。离子交换凝胶：以凝胶为母体，如葡聚糖，结合一定的离子基团生成的离子交换葡聚糖凝胶；琼脂糖等。如DEAE-SephadexA25、A50，CM--SephadexC25。河北大学生命科学学院离子交换剂的作用原理如下：阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。R—S03-H++Na+==R—S03-Na++H+阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。R—N+(CH3)30H-+Cl-==R—N+(CH3)3C1-+OH-河北大学生命科学学院离子交换剂的选择河北大学生命科学学院操作要点1．交换剂的预处理、再生和转型酸－碱－酸；或碱－酸－碱用0．5mol／LNaOH和0．5mol／LNaCl混合溶液或0．5mol／LHCI溶液处理(室温下处理30分钟)。河北大学生命科学学院2.装柱：测流速3.样品上柱、洗脱和收集上样？mL。记录出峰时间。OD值的改变。4.结束