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六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用主要应用：1.提高次级代谢产物的产量2.改进代谢产物的组分3.改进菌种的生理性能4.产生新的代谢产物㈠提高次级代谢产物的产量基因工程技术提高抗生素产量的主要手段1.增加限速酶的基因拷贝数2.增加正调节基因，去除负调节基因3.增加抗性基因的拷贝数六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用1.增加限速酶的基因拷贝数原理：ABCDE（代谢产物）EaEbEcEd限速酶Rate-limitingBottleneck例1：起始原料ACV三肽异青霉素N青霉素EaEbEcα-aminoadipicacidL-cvstcincEa：ACV合成酶Ec：异青霉素N酰基水解酶L-valincEb：异青霉素N合成酶青霉素酰基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响菌株原始菌株低产菌株Wis54-1255高产菌株AS-P-78IPNS的基因拷贝数1----9-14mRNA1----32-64青霉素产量100%导入带IPNS的基因片段140%六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加IPNS基因提高青霉素产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例2.头孢菌素C的生物合成的限速酶在头孢菌素C的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另一种产物-青霉素N。问题：积累中间产物-青霉素N原因：下一步反应为限速酶反应解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因结束：使头孢菌素C的产量提高25-50%，积累的青霉素N消失。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶基因提高头孢菌素C的产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子-3：例3.十一烷基灵菌红素产生菌：天蓝色链霉菌S.colocolorA3(2)acetylCoA构建重组质粒（带甲氧基转移酶）Polyketidepathway转化到氧甲基转移酶缺陷变株转化菌株十一烷基灵菌红素产量提高5倍S-酰苷甲酰氨酸氧甲基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子-4：例4.泰洛星（Tylosin）产生菌：氟式链霉菌（S.fradiae）acetylCoA+malonyCoAPolyketidepathway构建重组质粒（带甲氧基转移酶）转化到氟式链霉素（S.fradiae）泰洛星（Tylosin）产量显著提高甲氧基转移酶大菌素（macrocin）Tylosin转化菌株六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加正调节基因，去除负调节基因调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水平的表达，提高了代谢产物的产量。反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因基因效应菌株次级代谢物功能brpA正吸水链霉素Bioalaphos激活bar（Bialaphos抗性基因和6个bap（生物合成）基因的转录ty1G正弗式链霉菌泰洛星激活tylF（编码MOMT）和其它tyl生物合成基因的表达actII正天蓝色链霉菌放线紫红素能使act菌株放线紫红素的产量增加30~40倍mmy负天蓝色链霉菌次甲霉素该基因的插入失活导致次甲霉素过量生产strR正灰色链霉菌链霉素调节链霉素的生物合成调节基因在次级代谢产物合成中的作用六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用去除负调节基因时结构基因超量表达Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉菌携带的质粒SCPI编码的。在其生物合成结构基因的上游，存在一个负调节基因-mmy克隆到质粒上转化变青链霉菌转化子（次甲霉素高产表达）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加抗性基因的拷贝数抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身的代谢产物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：1.抗性基因产物（酶）将抗生素作用的底物加以修饰；2将抗生素的分子结构加以修饰，使其失活；3将抗生素分子排出细胞外。提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提，此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量例1.DaviesJ.利用链霉菌质粒pIJ702从卡拉霉素产生菌克隆了6‘-N-氨基糖苷乙酰转移酶AAC6’的基因（aacA），该基因产物在乙酰辅酶A的存在下，可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖6‘乙酰化。将aacA基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中，结果显著提高了抗生素的产量。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用卡拉霉素6’-乙酰转移酶[AAC(6’)]的作用六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量-2螺旋霉素抗性基因srmB例2.重组质粒转化S.ambofaciens（生二素链霉菌）转化子使螺旋霉素产量提高六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用㈡改进代谢产物的组分链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每个化合物称它为它的一个组分。多组分产生的分子基础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在。通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除该分支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用组分，提高有用组分的含量。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例一：阿维菌素产生菌的基因改造六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素“B”组分转化成“A”组分的分子基础六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素C5位的甲基化六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素生物合成基因簇六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用1.用基因工程手段灭活C5-氧甲基转移酶基因主要过程：1.克隆阿维菌素生物合成的aveD基因2.构建genedisruption质粒3.转化阿维菌素产生菌（S.avermitilis）4.挑选双交换菌株5.阳性菌株的发酵6.发酵产物的组分分子（HPLC，质谱）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用DisruptionplasmidofaveDgene六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用双交换菌株（阻断变株）的挑选六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用发酵产物的HPLC分析六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用D24-1组分的质谱分析六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.只产生Avermectin“2”组分基因工程菌的构建六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用aveC基因在染色体上的位置图aveC，aveE基因在阿维链霉菌生物合成基因簇中的位置六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用重组质粒的构建图质粒pC05的构建过程六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用重组质粒的转化六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用Genereplacement（基因置换）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用遗传型的改变六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用基因工程菌AveC-9发酵产物的HPLC分析Control基因工程菌AveC9阿维链霉菌aveC基因阻断变株产物的HPLC分析六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例一：黑暗链霉菌的基因改造黑暗链霉菌首先是从墨西哥土壤中分离得到的，1967由美国礼莱公司（EliLilyCo.）最初报道了黑暗链霉菌产生的代谢产物-尼拉霉素复合物，它包括1、1‘、2、4、5、5’、6、7等15个组分。其中组分2、4、5‘为尼拉霉素的主组分，其他组分为小组分。组分2为安普霉素（Apramycin），组分4为6“-O-氨甲酰卡那霉素B（6”-O-CarbamoylkanamycinB,CKB），组分5’为6“-O-氨甲酰托普霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）七八十年代，我国中科院微生物所与四川抗生素工业研究所先后分离到黑暗链霉菌的新菌株：黑暗链霉菌410与黑暗链霉菌83-1050B，它们的组分中含有尼拉霉素组分2、4、5‘。经过“七五”攻关中筛选到了只产组分2（Apramycin）、5’（6“-O-Carbamoltobramycin，CTB）的菌株U-135。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用黑暗链霉菌（S.tenebrarius）菌株U-135产生的两种主要抗生素六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用妥布霉素（Tobramycin）妥布霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组分5‘。它对革兰氏阴性菌有很高的抗菌活性。特别是对绿脓杆菌有独特的抗菌作用，因此常用来治疗烧伤后的绿脓杆菌感染。临床上使用的妥布霉素是由黑暗链霉菌经过发酵后，经过树脂吸附，层析后得到中间产物6”-O-氨甲酰托普霉素，然后再将6“-甲酰基水解掉，得到妥布霉素。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用安普霉素（Apramycin）Abriefintroductiontoapramycin安普霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组分2.它对革兰氏阴性菌和葡萄糖球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌仍有抑制和杀灭作用，与常用的氨基糖苷类抗生素不易产生交叉耐药性。80年代在美国和欧洲安普霉素作为兽用抗生素和饲料添加剂投入市场。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用安普霉素/妥布霉素生物合成基因簇的位置1.通过鸟枪克隆法从黑暗链霉菌H-6中克隆到了安普霉素抗性基因aprR2.在抗基因上游片段找到一个完整的ORF，定名为aprA。3.将抗性基因上游片段和报告基因crmE，xyIE插入到带有aprA片段的质粒。pHZ132中，得到重组质粒。4.转化黑暗链霉菌得到双交换的菌株42#菌株。5.对42#菌株发酵产物的分析表明，只产生单一的组分6”-O-氨甲酰托普霉素。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用㈡产生新的代谢产物必特霉素即将结束Ⅲ期临床实验进入市场，这是迄今为止，国内外唯一即将实现产业化的利用基因工程技术获得的“非天然”抗生素六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用㈡产生新的代谢产物六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用㈡产生新的代谢产物六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用