液相及液质分析方法学的开发及验证

HPLC及HPLC/MS分析方法的开发及其在药物分析中的应用李晓东中国食品药品检定研究院北京100050E-mail:[e-mail]2•基于分离分析科学技术–小颗粒填料的色谱柱–以光谱、质谱技术作为检测手段•专属性、分离效率及灵敏度–适用于广泛的色谱应用–适用于开发新方法–适用于现有方法的改进HPLC及HPLC/MS法3•质量源于设计（QualitybyDesign，QbD）准则•实验设计方法学（DesignofExperiment，DoE）•方法验证（MethodValidation）：确保方法在样品分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。分析方法学的开发及验证4方法开发实验室获得方法及运用过程方法验证方法确认方法转移准确度，精密度，专属性，检测限，定量限，线性，范围，耐用性分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等）及优化（梯度、柱温、流速等）法定检验方法在使用环境中适用性评估（人员、仪器、样品、试剂）非法定检验方法在实验室之间传递的文件化过程5实验室获得方法及运用过程方法验证方法确认-用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法-用一个确定方法来挑战现实的分析环境-专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ-一般不需要进行线性，范围，耐用性实验6ICH、USP1225、ChPIIAppendixXIXA方法验证的内容准确度（Accuracy）精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度专属性（Specificity）检测限（LOD）定量限（LOQ）线性（Linearity）范围（Range）耐用性（Robustness）7方法验证-系统适用性•系统适用性试验的内容–在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系统之性能达到规定的要求–塔板数，拖尾因子，分离度–确定重现性（%RSD）•系统适用性“样品”–主组份与预期副产物之混合物–系统适用性试验是色谱方法的一部分8方法验证-系统适用性•容量因子–k'2•精密度/进样重复性•RSD1%,n5•分离度–Rs2(主峰与最近洗脱的色谱峰之间)•拖尾因子–T2•理论塔板数–通常N20009方法验证-USP1225•类型1–主组份或活性成份定量分析方法•类型2–杂质或降解化合物测定方法•类型3–性能特点之确定分析方法•如溶出度实验•类型4–鉴别试验10方法验证-USP1225验证的内容类型1定量限度试验类型3类型4鉴别试验准确度++**-精密度++-+-专属性+++*+检测限--+*-定量限-+-*-线性++-*-范围++**-类型2*可能需要，具体与特定试验的性质有关。11如何进行方法验证•分析实验阶段–按照规定的实验计划或步骤•通常需要3到5天–在不同操作条件下，进不同浓度的试样–原料及制剂皆需分析•数据分析阶段–对分析结果进行统计学计算•色谱结果是相对的•用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真实变化12方法验证步骤线性Day1-3定量限检测限实验参数2Min&Max耐用性实验参数3Min&Max实验参数4Min&Max六次空白样品的基线噪音定量限精密度定量限原料药浓度4原料药浓度3原料药浓度2原料药浓度1原料药浓度5原料药精密度1-3天六次重复,100%原料药实验参数1Min&Max浓度4:120%原料及制剂浓度3:100%原料及制剂浓度2:80%原料及制剂浓度1:60%原料及制剂浓度5:140%原料及制剂13•每一方法验证的过程由80到100次分析组成•每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分离度等……）•每一组分最终得到总共约700个数字•所有这些数字需要进行数学处理：–手工处理（计算器，ExcelMacro’s等）–专用的方法验证程序方法验证的复杂性14液相色谱的方法开发15液相色谱的方法开发•根据分析物的化学性质选配色谱条件–基于既往经验及思考进行合理猜测–通常辅以资料参考–询问同事•“步进式”测试开发–基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行•系统性筛选策略–先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试•评估结果，选择最有效的条件组合–再进行方法优化•梯度/温度16影响分离度的因素选择性最为重要11kk4NRsMaximizedinUPLCSeparationsby:RangeofcolumnchemistriesMultipleparticlesubstratesWideusablepHrangeHighretentivityWiderangeinselectivityMaximizedinUPLCSeparationsby:Ultra-lowdispersionsystemSmall[2µm]particlesHigherpressurecapabilityWell-designedcolumnsImpactonResolutionDoubleNDoublekDoubleα%Improvement20–40%15–20%400%17影响分离度的因素18UPLC技术加速方法开发过程能够在一个工作日内完成方法开发!•对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行系统性筛查•高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨分离在更快的同时分离能力不打折扣•可自动选择色谱柱和流动相•四元溶剂或二元混合使方法开发更方便19固定相有机溶剂流动相pH值梯度影响选择性的主要因素20固定相21固定相Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane传统硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口硅羟基22固定相键合相(配体)：C18残留硅羟基端基封口基团硅胶基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口23固定相FlMinutes0.001.202.403.604.80CSHC18CSHPhenyl-HexylCSHFluoro-PhenylHSSC18SBIAPFlFeDOIAPFlFeDOIAFlFeDOIAPFlFeDOPAcetonitrile,0.1%formicacid(pH3)TestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]24固定相Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene铝杂质含量~375ppmTfUSP=6.5流动相pH7传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响25固定相与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基趋于中性(未解离)BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理26固定相低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！AU0.000.020.04Minutes0.002.004.006.008.0010.00AU0.000.010.020.030.04Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00pH7.0pH2.0阿密曲替林去甲阿米替林27固定相未浸润的孔浸润的孔注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！低有机溶剂或纯水溶液流动相C18硅胶28固定相Minutes0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物没有保留起始：填料完全浸润－“Wetted”停止流速后：填料完全脱离浸润状态－“De-Wetted”丧失浸润现象：100%水溶液中保留完全丧失29流动相•甲醇–质子化溶剂[氢键供给者]–洗脱能力较乙腈弱–粘度较乙腈高–低紫外波长下有吸收•乙腈–非质子化溶剂[氢键接受者]–洗脱能力较甲醇强–粘度较甲醇低–低紫外波长下透光性好30流动相Jenkins,DiehlRP18LowpH(pH3)100%MeOH100%ACN1:1ACN:MeOH1243562879610121189101110,1112128,91672344315,751.Gentisicacid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroguinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dioseb(A)12.Octanophenone(N)31流动相pH值•影响带有可离子化官能团的分析物–胺–羧基–酚•有些化合物含有一个以上的可离子化官能团•改变流动相pH将使选择性发生极大改变32流动相pH值酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大中性化合物的保留不受pH影响SilicapHRangeHybridParticlepHRangeNeueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.pH0510152025303540024681012RetentionFactor(k)酸性碱性中性化合物碱性保留增强[B]酸性保留增强[HA]33固定相、溶剂和流动相pH的影响因素IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:I:Imipramine[B]A:Amitriptyline[B]Fl:Flavone[N]O:Octanophenone[N]碱性及中性化合物34固定相、溶剂和流动相pH的影响因素IAPFlFeDOFluoro-PhenylpH3,MeOHPC18pH3,ACNIAPFlFeDOIAFlFeDOC18pH10,ACNPhenyl-HexylpH10,MeOHIAPFlFeDOTestProbes:P:1-pyrenesulfonicacid[A]Fe:fenoprofen[A]D:diclofenac[A]酸性化合物35固定相、溶剂和流动相pH的影响因素•分析物在其未电离[中性]状态时保留较强•甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性•当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变•在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变•最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时36梯度洗脱•优点–单位时间的分离能力增加－较大的峰容量–检测灵敏度提高•缺点–仪器设备要求高–不适合某些检测方式–色谱柱需再生–定量分析的重复性较低37梯度洗脱•高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A泵溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）38梯度洗脱滞后体积死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路！比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送