液相色谱仪常用操作步骤

液相色谱仪常用操作步骤1)．首先对流动相进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为有机系和水系，常用的孔径为0.22um和0.45um。2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)．正常情况下，仪器首先用甲醇冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相(如流动相为缓冲试剂，则要二次重蒸水冲洗10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止)。4)．一般情况下，流动相冲洗20-30分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。5)．同时进两针标样，将其结果相比较，其结果的比值在0.98-1.02之间后，就可以正式进行样品的测试了。6)．样品测试结束后，就要进行色谱仪及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓冲试剂，同样也要用重蒸水清洗10-20分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。7)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。8)．填写登记本，由负责人签字。注意事项：1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。4)．压力不能太大，最好不要超过150kgf/cm2.5).因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。气相色谱仪操作规程一载气钢瓶的使用规程1钢瓶必须分类保管，直立因定，远离热源，避免暴晒及强烈震动，氢气室内存放量不得超过二瓶。2氧气瓶及专用工具严禁与油类接触。3钢瓶上的氧气表要专用，安装时螺扣要上紧。4操作时严禁敲打，发现漏气须立即修好。5用后气瓶的剩余残压不应少于980kPa。6氢气压力表系反螺纹，安装拆卸时应注意防止损坏螺纹。二减压阀的使用及注意事项器仪表同1在气相色谱分析中，钢瓶供气压力在9.8-14.7MPa。2减压阀与钢瓶配套使用，不同气体钢瓶所用的减压阀是不同的。氢气减压阀接头为反向螺纹，安装时需小心。使用时需缓慢调节手轮，使用权后必须旋松调节手轮和关闭钢瓶阀门。3关闭气源时，先关闭减压阀，后关闭钢瓶阀门，再开启减压阀，排出减压阀内气体，最后松开调节螺杆。三微量注射器的使用及注意事项1微量注射器是易碎器械，使用时应多加小心，不用时要洗净放入合内，不要随便玩弄，来回空抽，否则会严重磨损，损坏气密性，降低准确度。2微量注射器在使用前后都须用丙酮等溶剂清洗。3对10-100微升的注射器，如遇针尖堵塞，宜用直径为0.1mm的细钢丝耐心穿通,不能用火烧的方法。4硅橡胶垫在几十次进样后，容易漏气，需及时更换。5用微量注射器取液体试样，应先用少量试样洗涤多次，再慢慢抽入试样，并稍多于需要量。如内有气泡则将针头朝上，使气泡上升排出，再将过量的试样排出，用泸纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。6取好样后应立即进样，进样时，注射器应与进样口垂直，针尖刺穿硅橡胶垫圈，插到底后迅速注入试样，完成后立即拔出注射器，整个动作应进行得稳当，连贯，迅速。针尖在进样器中的位置，插入速度，停留时间和拔出速度等都会影响进样的重复性，操作时应注意。四热导池检测器的使用及注意事项1开启热导电源前，必须先通载气，实验结束时，把桥电流调到最小值，再关闭热导电源，最后关闭载气。2稳压阀，针形阀的调节须缓慢进行。稳压阀不工作时，必须放松调节手柄。针形阀不工作时，应将阀门处于“开”的状态。3各室升温要缓慢，防止超温。4更换汽化室密封垫片时，应将热导电源关闭。若流量计浮子突然下落到底，也应首先关闭该电源。5桥电流不得超过允许值。五氢火焰检测器的使用及注意事项1通氢气后，待管道中残余气体排出后，应及时点火，并保证火焰是点着的。2使用FID时，离子室外罩须罩住，以保证良好的屏蔽和防止空气侵入。如果离子室积木，可将端盖取下，待离子室温度较高时再盖上。工作状态下，取下检测器罩盖，不能触及极化极，以防触电。3离子室温度应大于100℃，待层析室温度稳定后，再点火，否则离子室易积水，影响电极绝缘而使基线不稳。液相色谱仪的使用和维护注意事项一、泵的使用和维护1、防止固体微粒进入泵内。因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、密封环、缸体和单向阀。泵的入口都应连接砂滤棒，输液棒的滤器经常清洗或更换。2、流动相不应含有任何腐蚀性物质。例如氯仿、丙酮、二氯甲烷等，这些溶剂将会Peek树脂部件变脆；还有含有卤离子的流动相或能产生卤离子的流动相，如果使用了，分析结束后，应立即用去离子水清洗整个管路，因卤离子会腐蚀不锈钢部件或管路。流动相含有缓冲盐不应停泵保留在泵内时间过长，由于蒸发甚至由于溶液的净置就可能析出晶体。3、泵工作时要注意流动相不要被用完，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低密封圈使用寿命。4、在使用双泵过程中，如果不是梯度洗脱，尽量先混合。如果一个是有机溶剂，一个是含盐溶液，在用双泵的时候，有可能会析出晶体。5、在使用缓冲盐作流动相实验结束之前和结束后，都要用含10％甲醇水溶液冲洗管路，不能用纯水冲洗，因纯水会对柱子造成损坏。进样阀要用适宜的溶剂进行清洗。二、色谱柱的使用和维护1、避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更不能停留在中间，如停留在中间，泵内压力剧增，这时再转动到进样位置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉在地上）则会改变填料的充填状态。2、在使用色谱柱过程中，不应直接从有机溶剂到水，反之，也不要从水直接改变到有机溶剂。3、色谱柱一般不能反冲，除非生产者指明。4、冲洗色谱柱时，每种溶剂至少冲洗50ml。5、装在机子上的色谱柱，应每隔4～5天冲洗15分钟，可以避免长菌，保护色谱柱。6、PH的调节尽量在2～9之间7、保存色谱柱时，柱接头要拧紧。三、输液泵产生故障及排除方法1、没有流动相流出，又无压力显示。原因可能是泵内有大量气体，这时打开排液阀，使泵在较大流量下运转，将气体排出，也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因使密封圈损坏。2、压力和流量不稳。原因①可能有气泡；②单向阀污染，可卸下单向阀，浸入异丙醇内超声清洗；③沙滤棒内有杂质或微生物堵塞，可将沙滤棒浸入流动相中超声清洗，也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中，迅速除去微生物。也可能是盐堵塞，可放入水中清洗；④在线过滤器堵塞⑤进样阀损坏；⑥密封圈性能不好。3、压力过高。①管路堵塞；②保护柱堵塞；③检测池堵塞，发生情况立即停泵，否则会损坏流通池。四、与检测器有关的故障及其排除1、流通池内有气泡。如果有气泡连续不断通过检测池，将其噪音增大。如有较大气泡，则会在基线上出现许多线状“峰”，可加大流量排出气体。如果检测池有停留的气泡，可采用突然增大流量的方法排除气体（不连接色谱柱）。2、检测池被污染。检测池被污染了，可能产生噪音，或基线漂移，可以使用适当溶剂清洗，如果污染严重，就可以用1mol/l硝酸溶液、水和新鲜溶剂进行清洗。3、光源灯出现故障。检测器的光远灯不能满足正常样品分析时，可能产生严重噪音污染，基线漂移，出现异常峰，甚至基线不回零。4、出现倒峰。如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，就会产生倒峰，必须用高纯度的溶剂作为流动相。检测器的极性接反了，也会出现倒峰。液相色谱仪色谱柱使用及维护每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的补偿，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------一定得做！新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。卡套柱的安装（不加预柱）1．将卡套架套入柱芯2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图）3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。卡套柱的安装（加预柱）1．将卡套架套入柱芯2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图）3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片4．将子弹头预柱放入卡套片内5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水过渡。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡如何平衡色谱柱？平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）色谱柱的再生进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。表1建议用来冲洗的溶剂体积色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积125-41.6ml30ml250-43.2ml60ml250-10-20ml400ml请根据下表选择您的再生方法：极性固定相（如Si，NH2，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱注意：在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。色谱柱的维护1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围3．避免流动相组成及极性的剧烈变化4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中6．压力升高是需要更换预柱的信号高效液相色谱仪的几个使用问题色谱常见问题问答■问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?答：关于漂移问题：1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合■问：色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题?答：1、柱效要高2、热稳定性好3、化学惰性强具体选择应注意：1、柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行