液质联用技术的原理与应用 (2)

质谱法及其联用技术的原理与应用解题质谱法（MassSpectrometry,MS）有机/无机/生物/同位素MS质谱仪可直接进样常见仪器分析技术液相色谱法（LC）气相色谱法（GC）毛细管电泳法感耦等离子体（ICP）原子发射光谱法……解题为何要联用？以LC-MS为例：LC的色谱分离＋MS的质谱分离（m/z分离）两个维度依次分离，是乘法，非加法！结合了LC和MS二者的优点辨证地看待“联用”仪器的小型化、微型化，如waters公司的Qda检测器；ICP-MS。Waters公司的液质联用仪QqQQTOFSciex公司的质谱仪QTRAPQTOFQqQOrbitrapThermoFisher公司的液质联用仪Agilent公司的质谱联用仪ICP-QqQ质谱仪GC-QqQ质谱仪用途和优点以LC-QqQ-MS定性、定量最常用的多反应监测（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式为例灵敏度高准确地说——信噪比高LC：μg/mL（ppm）LC-MS：ng/mL（ppb）、pg/mL（ppt）特异性好干扰小，定性准确降低了对样品前处理的要求是公认的确证分析技术！低分辨率质谱仪用途和优点以QTOF和Q-Orbitrap为代表：质量准确度高（m/z精确到小数点后3-5位）定性筛查的利器：半未知、全未知化合物如：北京CDC高分辨率质谱仪从历史谈起离子源和质量分析器有多种不同的类型以两大主线介绍质谱仪的发展史进样系统离子源（使分析物电离）离子光学系统质量分析器（实现m/z分离，质谱仪通常据其命名）检测器真空系统计算机系统质谱发展史上的两位先驱1897年，J.J.Thomson（汤姆孙，1856～1940）质谱仪的雏形1919年，F.W.Aston（阿斯顿，1877～1945）首次制成具有较高聚焦性能的质谱仪，用其成功发现了多种同位素，获1922年的诺贝尔化学奖质量分析器发展史1917年，Dempster发明扇形磁场质谱仪（扇形磁场分析器）1934年，Mattauch和Herzog1953年，Johnson和Nier分别设计出了两种双聚焦质谱仪（扇形磁场分析器＋扇形电场分析器）1946年，Stephens发明飞行时间（Time-of-Flight，TOF）质谱仪1949年，Hipple发明离子回旋共振（IonCyclotronResonance，ICR）质谱仪，是首个超高分辨率质谱仪质量分析器发展史1953年，W.Paul（保罗，1913～1993）提出四极质量分析器（QuadrupoleMassAnalyzer，QMA）和四极离子阱（QuadrupoleIonTrap，QIT）的理论，随后出现了四极质谱仪和QIT质谱仪H.G.Dehmelt（德梅尔特，1922～）对ICR质谱仪的发展作出突出贡献与Paul共享了1989年诺贝尔物理奖的一半质量分析器发展史1977年和1984年两种重要的串联质谱仪——三重四极（TripleQuadrupole，QqQ）质谱仪和QTOF质谱仪诞生1995年和1998年，Bier等和Hager分别设计出了两种线性离子阱（LinearIonTrap，LIT）1999年，A.Makarov（1966～）全新概念的分析器——轨道阱（Orbitrap）离子源发展史气体放电电离、火花电离、辉光放电电离、热电离最出现的电离技术，属于无机电离技术1918年，A.J.Dempster发明电子电离（ElectronIonization，EI）最早的有机电离技术，至今仍广泛使用1954年，Inghram和Gomer场电离，最早的“软”电离技术1966年，Munson和Field发明化学电离（ChemicalIonization，CI）离子源发展史1969年，Beckey场解吸，打开了MS用于生物大分子分析的大门1980s，Fenn（芬恩，1917～2010）使电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）取得重大突破1973年，Horning大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）1980年，Houk以电感耦合等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）为离子源，发明了ICP-MS，是元素分析的利器离子源发展史1987年，Tanaka（田中耕一，1959～）将基质辅助激光解吸电离（Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization，MALDI）用于蛋白质分析；因将ESI和MALDI引入生物大分子领域的卓越贡献，Tanaka与ESI的发明者Fenn分享了2002年诺贝尔化学奖的一半MS基本原理MS是与光谱法、核磁共振波谱法并称的三大物质定性手段之一MS是通过形成气相离子来研究物质的一种方法，根据质量、电荷、结构和（或）理化性质的差异，运用质谱仪对离子进行表征提前是化合物能形成离子m/z分离通过质量分析器实现（电场；磁场；电场＋磁场）关于m/z的理解什么是“质”？什么是“荷”？用于描述微观离子质量的单位千克（Kg，SI单位，但单位太大）道尔顿（Dalton，Da）JohnDalton（1766～1844）统一原子质量单位（UnifiedAtomicMassUnit，u）1u＝1Da＝1.660538921（73）×10－27kg注：原子质量单位（AtomicMassUnit，amu，已废弃）关于m/z的理解相对质量VS绝对质量初中化学的重要概念“相对原子质量（原子量）”相对质量单位为“1”，绝对质量单位为u、Da等相对质量与以u为单位的绝对质量在数值上相等实际质量VS平均质量要区分“元素”和“原子”的质量。例如，原子质量是实际质量，元素质量是平均质量（考虑了同位素丰度）。原子量（是元素的质量）≠原子质量分子量（是元素质量的加和，MS中不能直接运用）同位素分布Sn的同位素分布同位素分布瘦肉精（C12H18Cl2N2O）的同位素分布同位素标记内标：选择占比较少的同位素组成形式质谱图质谱图（MassSpectrum）以离子的m/z为横坐标，质量峰的强度为纵坐标注意：质谱图并非指MS所得图谱的总称横坐标既非保留时间，也非离子质量a、轮廓图b、棒图提取离子色谱图质谱仪直接采集得到的是质谱图，经计算机加工得到色谱图质谱图是色谱图的基本组成单元分辨率分辨率（Resolution，R）反映的是相邻质谱峰的分离程度目前最常用的定义是“半峰全宽（FullWidthatHalfMaximum，FWHM）定义”分辨率低分辨率：R＜1000中分辨率：R＝1000～10000高分辨率：R＝10000～100000超高分辨率：R＞100000QMA是低分辨率，TOF和Orbitrap是（超）高分辨率通常，QMA的质谱峰的半峰宽为0.7质量准确度准确质量（AccurateMass）：实测值精确质量（ExactMass）：理论值质量准确度：二者的误差分辨率会影响质量准确度QMA的质量准确度一般为0.1u质谱仪简介SCIEX的QqQ和QTRAPTMThermoFisher的OrbitrapSCIEX、Waters、Bruker的QTOFBruker的FT-ICR价格GC-MSQ：～80万QqQ：～120万LC-MSQqQ：220～330万QTOF：300～400万Q-Orbitrap：400～600万ICP-MSQ：100～150万QqQ：200～250万质谱仪硬件组成进样系统直接进样（如注射泵）、色谱仪等离子源离子光学系统冷却、聚焦、准直等质量分析器检测器电子倍增器、微通道板等真空系统为何需要保持真空？为何通常需要待机？需要液氮，是否矛盾？计算机系统离子源离子源是使样品分子、原子或自由基转变为气相离子的器件，是质谱仪的“门户”有机MS中几种常见的离子源电子电离（ElectronIonization，EI）源化学电离（CI）源较“软”电离；需要试剂气；适合GC大气压电离（AtmosphericPressureIonization，API）源基质辅助激光解吸电离（MALDI）源适合蛋白质分析无机MS中几种常见的离子源感耦等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）源EI源曾称为“电子轰击（ElectronImpact，EI）”电离源特点“硬”电离分子离子、碎片离子；多用于一级MS质谱图重复性好API源顾名思义，API是在大气压而非高（如EI）或低（如CI）真空环境中实现的一类电离技术API源的出现，解决了色谱仪与质谱仪接口的难题，极大地推动了LC-MS的成熟API源主要包括以下3种类型电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）源大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）源大气压光电离（AtmosphericPressurePhotoionization，APPI）源ESI源SCIEX公司的ESI源ESI源Waters公司的ESI源（Z-Spray）ESI源Agilent公司的ESI源ESI的机理电离过程大致可分成三个阶段（以ESI＋为例）：第一阶段：使溶液分散成带电雾滴强电场→液滴形成泰勒锥→瑞利稳定极限→锥喷流（Cone-Jet）→约1mm后就迅速膨胀为羽流（Plume），即多个带正电荷的直径为1～2μm的雾滴（高压静电＋气动辅助）ESI的机理锥喷流的照片ESI的机理第二阶段是溶剂蒸发与雾滴-喷流分裂（Droplet-JetFission）溶剂蒸发→雾滴缩小→电荷密度增加→当达到瑞利稳定极限时→遂发生“雾滴-喷流分裂”→循环往复→体积越来越小ESI的机理第三阶段是产生气相离子，即离子从溶液中转移出来以气态存在离子蒸发模型（IonEvaporationModel，IEM）当雾滴半径达nm级时，高挥发性的离子聚集在雾滴表面，在强电场作用下发生场辅助蒸发，直接从雾滴中“弹出”，成为气相离子。带电残渣模型（ChargedResidueModel，CRM）该模型认为只有雾滴中的溶剂完全蒸发时，化合物才能继承多电荷形成一个气相离子。两种模型均有实验支持。一般认为，小分子化合物可用IEM解释，大分子化合物则用CRM解释ESI的特点在大气压下进行对比：EI在真空状态下进行“软”电离形成离子：加合离子[M＋H]＋、[M＋Na]＋、[M＋NH4]＋、[M＋Cl]－等；去质子化分子[M―H]－对比：EI是“硬”电离单电荷与多电离离子小分子以单电荷离子为主，大分子以多电荷离子为主基质效应可能存在基质增强或抑制如何判断是否存在？解决办法？（同位素标记内标、基质加标、改进样品前处理……）质量分析器1.四极质量分析器（QMA）定性、定量的利器；灵敏、特异，线性范围宽2.四极离子阱（QIT）捕获离子；可实现多级质谱法；定性能力强，定量能力不及QMA3.线性离子阱（LIT）离子容量比QIT大，许多性能优于QIT；有2种类型，其中一种为QTRAPTM（Q-LIT）注：以上3种质量分析器有共同的理论基础——Mathieu（马蒂厄）方程质量分析器4.飞行时间（TOF）质量分析器高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查5.轨道阱（Orbitrap）超高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查6.扇形磁场分析器7.扇形电场分析器不能单独组成质谱仪；与扇形磁场分析器组成双聚焦分析器（最早出现的分析器之一，辉煌的时代已成过去时……）8.离子回旋共振离子阱（ICR-IT）超高分辨率（高质量准确度）；价格十分昂贵四极质量分析器U是直流（DC）电压V是射频（RF）电压理论基础——Mathieu方程由法国数学家É.Mathieu（马蒂厄，1835～1890）于1868年提出，最初是为了解决椭圆形鼓膜的横向振动一类的问题，后来发现可用来描述离子在四极场中的运动