DNA测序的方法

DNA测序的原理及方法DNA测序的原理DNA测序的操作过程DNA测序实例Sanger法DNA测序的原理使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977），酶法DNA序列测定技术才得到广泛应用。2‘，3’ddNTP与普通dNTP不同之它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5‘三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3’羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上.DNA双脱氧法测序的原理及方法点击查看相关网页双脱氧法测序的原理单击查看DNA测序的动画演示DNASeqamit.exe常用测序方法手工测序•读序长度:约300bp•同位素32P,35S标记•结果通过人工肉眼分析氩离子激光器测序仪•读序长度:500-700bp•可见荧光Fam,Hex,Rox,Tamra标记•软件自动读序红外激光器测序仪•读序长度:1000-1400bp•红外荧光标记•软件自动读序DNAAnalysisSystemsIRD800NXNSO3+_OAbs.Max.:787nmEm.Max:807nmMolarAbsorptivity:200,000m-1cm-1QuantumYield:16.5%荧光标记染料种类IRD700NXNSO3+_Abs.Max.:685nmEm.Max:705nmMolarAbsorptivity:170,000m-1cm-1QuantumYield:50%IndependentChannelsDyesareseparatedby110nmDetectorfilterseliminatesignalcrossoverLasersexciteonlyonedyeatatimeContrastto4colorsNosoftwareinterpretationofdyespectraWith4colorsitisdifficulttodistinguishbetweenastrongsignalinonecolororaweaksignalinasecondcolorNodyemobilityshiftcorrections四色荧光分析检测DetectionLimitsDYE377(amole)373(amole)LI-COR(amole)IRD15Fam50100Hex150200Tamra250400Rox250800检测效果分析比较ATCG800nmDetectorLaser800nm700nmDetector700nmLaserSignalProcessingComputer电泳带型检测700800测序电泳图谱Channel700Channel800测序结果输出长片段测序策略BI-DIRECTIONALSEQUENCING5'3'3'5'IRD700IRD800TwoPrimers/TemplateTTCAGAC-----------------PRIMERPRIMER------------------AAGTCTG2000basesSBSOptionsMinimumoverlapLargestsinglestrandcoverageInserts~2kbMaximumoverlapConfirmedsequenceinonetubeInsertsof1200bases12000Bases11000Bases长片段的正反向测序SideView测序硬件LongReadIRDNASequencerGeneReadIRDNAAnalysisSystemBIOTECHNOLOGYDIVISIONSoftwareMultitaskingBaseImagIRSoftware3-Data=AccuracyDNA测序的应用SequencingMutationScreeningMutationAnalysisForensicHumanIdentificationMappingStudiesPrimerExtensionFootprinting总结单击查看DNA测序原理过程和策略