DNA甲基化对核小体结构的影响

DNA甲基化对核小体结构的影响报告人：沈伟2013.10.9•DNAMethylationIncreasesNucleosomeCompactionandRigidity•JohnS.Choy,SijieWei,JuYeonLee,SongTan,StevenChu,andTae-HeeLee*•DepartmentofChemistry,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,Pennsylvania16802,UnitedStates•J.AM.CHEM.SOC.VOL.132,NO.6,2010•EffectsofDNAMethylationontheStructureofNucleosomes•JuYeonLeeandTae-HeeLee*•DepartmentofPhysics,Bio-XProgram,StanfordUniVersity,Stanford,California94305,andDepartmentof•ChemistryandDepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,ThePennsylVaniaStateUniVersity,•UniVersityPark,PennsylVania16802••J.Am.Chem.Soc.2012,134,173−175JACS核小体：H2AH2BH3H4200碱基对的DNADNA甲基化有什么用？•同卵双胞胎也有不同•性状不全是由碱基的顺序决定•基因转录以染色质的解螺旋为前提•表观遗传•CPG岛----启动子•CpG甲基化----核小体的结构•了解基因表达•新药开发治疗CpG甲基化有关的疾病•ATTENTION:•癌症共同特征之一：•启动子区甲基化-抑癌基因失活•启动子附近的甲基化CpG岛可防止转录酶结合•转录抑制因子结合甲基化的CpG岛,即通过蛋白的作用致使染色质交联从而阻止转录•另外由于DNA和组蛋白结合在一起，还可能是甲基化改变了核小体的结构甲基化如何影响性状？anyway，并不否认前两种假设存在•我们关心的：•可否证实第三种假设属实呢？----怎么检测？•单分子检测更加直观，全面，精确•(fuorescenceresonanceenergytransfer,FRET)单分子荧光共振能量转移技术SMFRETmeasurementsSinglemoleculefluroescenceintensitiesweretakenwithasensitiveCCDcamera(iXon+897,AndorTechnology,BelfastUK)inaprismcoupledtotalinternalreflection(TIR)geometrybasedonacommercialmicroscope(TE2000,Nikon,TokyoJapan)withmodifications.TheexcitationisperpendicularlypolarizedalongtheTIRincidence.Imagingwasdoneinabufferwith10mMHEPESpH7.6,50mMNaCl,5mMMgCl2,1mMDTT,6%glyceroland0.4%glucose.Glucoseoxydase(0.08U/uL,SigmaAldrich)andCatalase(2.3U/uL,SigmaAldrich)mixturewasusedtoelongatethedyephotobleachinglifetime.•荧光共振能量转移效率理论公式主要检测什么？荧光共振能量转移效率实际测量公式---------可以由测得的荧光能量转移效率和求得的常量R0来计算出：能量供体与受体间的距离R即DNA两端的实际距离•测得不同的FRET效率•↓•代表不同的DNA实际两端距离•↓•表示DNA不同的缠绕方式•↓•不同的核小体结构单分子的构建天然凝胶电泳cy3，cy5channel两种核小体带FRET检测结果蓝色表示FRET效率红色绿色表示荧光强度，即所占数量FRET0.29FRET0.4FRET0.29-0.4DNA甲基化如何影响核小体结构？•DNA与组蛋白作用的强弱•强则DNA短，结构封闭•弱则DNA长，结构松散•除了FRET效率支持这个解释，•荧光的各向异性也可以解释偏振度FRET效率高对应的荧光偏振度也高，说明核小体结构更紧密•进一步的，该课题组做了更深入的研究发现•CpG基甲基化•DNA紧密包裹组蛋白核心拓扑结构的变化。两种不同的核小体构建两种核小体甲基化前后的FRET效率对比601+39核小体甲基化前后偶极子取向角变化conclusion•CpG甲基化对核小体的结构的以下影响：•DNA更紧密的缠绕组蛋白，刚性增加•拓扑结构的变化，DNA缠绕增多•两者都有利于形成抑制性（不活跃的）的染色质结构，抑制基因表达•首创性•单分子检测该工作的亮点QUESTION•为何没有直接观测核小体结构变化？•能否定量？•谢谢！