DNA甲基化检测专题 枫树海树枝

——MSPvs.BSPDNA甲基化检测专题4DNA甲基化基本概念1235DNA甲基化生物学作用DNA甲基化检测意义DNA甲基化检测方法DNA甲基化PCR特点DNA甲基化PCR影响因素6DNA甲基化基本概念DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNAmethyl-transferase,Dnmts）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态，如管家基因；去甲基化状态，如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态，如女性的一条失活的X染色体。DNA甲基化主要形成5-Mc和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA甲基化是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用，是调节基因表达的机理之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化且两个甲基基团在DNA双链大沟中呈特定三维结构（CpG）。CpG序列在哺乳动物基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。DNA甲基化基本概念CpG岛（CpGIsland）结构基因组中70-90%的独立CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG岛。CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛（结构基因启动子的核心序列及转录起始点）。CpG岛的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达，即基因表达的调控开关。DNA甲基化生物学作用DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li等1992年和Okano等1999年）。此外，等位基因的抑制(allelicrepression)被印记控制区(imprintingcontrolregions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-WiedemannSyndrome,BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等。1.DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育2.DNA甲基化与肿瘤目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。Uhlmann等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的7种肿瘤标志基因存在着不同程度的甲基化。因此，甲基化的研究为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达和抑癌基因的不表达）。继人类基因组计划结束后，2003年人类表观基因组协会(HumanEpigenomeConsortium,HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。DNA甲基化检测意义其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。甲基化检测方法分为两类，甲基化分型(methylationtyping)甲基化图谱(methylationprofiling)，后者又被称为甲基化组学(methylome)。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。DNA甲基化检测方法甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测，多为单基因的甲基化检测。甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。根据研究所用处理方法不同，即DNA的甲基化修饰（指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团，形成5甲基胞嘧啶）。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种：由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。1.甲基化敏感性内切酶2.亚硫酸氢盐的修饰3.特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白4.质谱或色谱等精密检测手段DNA甲基化PCR特点结合重亚硫酸盐的测序法（BisulfiteGenomicSequence,BSP）甲基化特异性的PCR（methylation-specificPCR,MSP）重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行PCR。PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。1.特异性高，能够提供高特异性的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；2.灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。关键:MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链(M)，另一对结合处理后的非甲基化DNA链(U)。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。1.检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA；2.快速、简单，省时；DNA甲基化PCR影响因素甲基化PCR扩增中存在许多因素可导致其扩增失败。调研分析发现引物设计的是否合理决定了甲基化PCR扩增的成败与否，而样本的处理好坏与反应温度的选择决定着甲基化PCR扩增产物的产量与纯度。总之，其影响因素归纳总结主要有以下几个方面：引物因素，反应体系因素，反应温度因素三大方面。1.引物因素甲基化PCR引物设计的好坏是甲基化PCR扩增是否成功的关键因素。甲基化PCR引物设计原理：样品的DNA经亚硫酸盐处理后，发生甲基化的CpG岛碱基C不变，而未发生甲基化的CpG岛碱基C则变为尿嘧啶U，即C—U。甲基化PCR，最好是含有多个CpG岛，以保证引物的高特异性，同时可提高DNA甲基化碱基的检出率。甲基化PCR中未甲基化引物序列中正向引物不含鸟嘌呤碱基（G），反向引物不含胞嘧啶碱基（C）且引物设计尽可能满足普通PCR引物设计的原则MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率30％的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化正向引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。2.反应体系因素甲基化PCR的反应体系一般与普通PCR体系一样，但针对甲基化PCR的DNA模板，须在抽提后检测其纯度和含量。其纯度要求；其含量准确测定，否则在亚硫酸盐处理时会因加入的DNA模板太多会导致DNA处理不完全而导致甲基化PCR扩增失败，而加入模板太少则会因目的片段少导致假阴性且浪费试剂。同时，甲基化PCR的DNA模板在抽提后要做一个初步电泳，看抽提的DNA模板是否完整。电泳后，若只有一条带则表明抽提的DNA模板是完整的，反之，得重新提取DNA。因为DNA模板的断裂处若正好是目的片段所在处，则会导致甲基化PCR扩增失败。Mg2+浓度一般在2.0-2.5mmol/L为宜，过高或过低都不利于扩增。Taq酶一般选择针对富含GC等复杂二级结构模板的Buffer与酶，一旦使用不要轻易更换，以免MSP因重新优化引起时间和成本浪费。亚硫酸盐处理模板的过程要严格按照操作说明操作，避免DNA模板处理不完全。经亚硫酸盐处理后的。DNA模板应保存在-20℃下，且使用不超过2M。3.反应温度因素甲基化PCR扩增结果有三种情况：1.产物电泳为阴性；2.产物电泳出现多条非特异性带；3.产物电泳为阳性。出现1、2两种结果时，在保证反应体系和引物设计没问题的前提下，可通过调整甲基化PCR的反映温度去获取目的片段。由于PCR反应中，Tm的高低与GC含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中会出现PCR偏性，则可提高预变性温度(一般应95℃，10min)和变性温度(95℃，1min)，退火温度以60℃做梯度或70℃做降落PCR。亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L。修饰时间控制在10-16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化为尿嘧啶且DNA模板破坏加剧；时间过短会导致修饰不彻底。从而可能出现PCR只能扩出U，M出不来。反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；，以保证修饰完全。4.其他BSP对酶的要求比较高，最好选用hotstart的酶BSP:PCR产物最好不要超过300bp否则比较难TouchdownPCR对BSP很好用(对所有有falsepriming问题的PCR应该都有用),一般从Tm高几度开始,到低5度结束,效果很好BSP:对于GC%高,CpG很多(200~2000bp),可把bisulfite浓度和incubationtime都加大,就出来了，然后再用kit的试剂,多run两个变性-转化的循环,结果也不错bisulfiteconversion之后的DNA跑胶EB染色是看不见的,因为这时候DNA基本上都是单链了(转化之后两条链不再互补)引物设计——获取启动子区域序列1）附：DNA甲基化引物设计步骤2）=no引物设计——设计引物1）附：DNA甲基化引物设计步骤2）提取DNADNA甲基化检测与测序分析附：DNA甲基化引物设计步骤凝胶电泳检测测序分析