DNA甲基化检测方法

DNA甲基化检测方法总览主要检测途径•基于重亚硫酸盐转化的方法(金标准)•不基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析•水解核苷酸•质谱分析用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析图6PMVK基因扩增产物反向测序结果图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果应用二：重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)注：A：癌组织；B：癌旁组织；○：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果BSP克隆测序甲基化率三维图形优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间的甲基化状态的联系。缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费力，克隆子的数目影响结果的准确性。测序重复性差。应用三：甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)UMUMUMladder100150200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果注：M表示甲基化，U表示未甲基化B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本；H2O为阴性对照；m为50bpMarker。SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态优点：①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材缺点：①引物设计要求高；②只能作定性研究；③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；④只能了解部分位点的甲基化状态。对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而实现甲基化的定量分析。优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照避免了电泳、酶切等操作缺点：PCRbias应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶图1-1MSRE-PCR原理图注：左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,DNA保持完整,可以获得PCR产物.采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白酶识别位点内含有一个及以上CpG位点应用条件：优点：①方法相对简单；②可进行甲基化水平的定量研究；③需要样本量少。缺点：①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；应用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP)基本步骤举例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesignedtoflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.ThedifferenceintheCtvalueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.MSREMDRE启动子区甲基化芯片技术Base-SpecificCleavagePrimerExtensionMethods质谱法检测的优势：灵敏度准确性高。操作较简便。局限性：DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。需用质谱仪。扩增基因组DNA样本重亚硫酸盐转化ExoSAP消化PCR引物延伸加入SNP引物和SNaPshotMixSNP引物延伸(加入ddT或ddC)SAP处理分析310/3100样本准备加入GS120LIZ内标ABI310/3100电泳选用E5和POP4胶数据分析（GeneScan）样本分型（Genotyper或GeneMapperID）步骤123456这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率。HRM技术：用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点鉴定感兴趣的CpG岛。HRM技术原理HRM技术原理HRM特点高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。高重复性：重复性100%。使用范围广：不受碱基位点局限。操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。缺点：检测序列长度不应超过100bp；只能进行半定量检测应用十二：焦磷酸测序法焦磷酸测序法（Pyrosequencing）焦磷酸测序法（Pyrosequencing）焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序焦磷酸测序的优势：灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。应用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethylDuplexPCRPrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobe[solidblack,labeledwithfuorescentdye(F)andquencher(Q)ina5’-exonucleaseassay,usedhereasanexampleforareal-timedetectionmethod].(B)WhentheDNAisunmethylated,theblockeroligonucleotidesbind,blockingtheaccessoftheprimerstotheirbindingsites.NoPCRproductisgenerated.samplethroughputversusgenomecoverage.AplotofsamplethroughputagainstgenomecoverageforvariousDNAmethylationtechniques.Throughputisdeterminedbythenumberofsamplesthatcanbeanalysedperexperiment,basedonlargeeukaryoticgenomes.CoverageisdeterminedbythenumberofCpGsinthegenomethatcanbeanalysedperexperiment.不同甲基化检测方法的检测通量1.筛选Differentiallymethylatedregion；课题流程：2.对筛选出的DMR进行测序，验证是否具有甲基化差异性，同时筛选出随龄变化相关性强的CpG位点；3.检测每个样本CpG位点的甲基化率，做回归分析。做回归分析需要的样本量很大，每个样本需要检测多个CpG位点。基于克隆的Sanger测序需要多个克隆子，操作繁琐，重复性差，成本会很高；焦磷酸测序需要对多个片段进行测序，样本量太大，成本会不小。对单个位点甲基化进行定量分析的方法有很多，个人觉得质谱法或者Ms-SNuPE可以考虑，RD-qAMP可以避免重亚硫酸盐转化，也可以考虑.其它的几个我感觉不太适合，譬如MS-PCR只能半定量，MethyLight存在PCRbias，BioCOBRA要求甲基化位点酶切位点内，MS-HRM和芯片检测的是片段甲基化状态，CHIP-sequence要求illumina平台。易老师你认为呢？