DNA甲基化酶

第二节甲基化酶MethylaseMethylationmethyltransferase原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。一、DNA甲基化酶甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5-甲基胞嘧啶（M5C）。M5C占整个胞嘧啶中的2～7%（果蝇和某些昆虫例外）。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物种或同一物种的不同组织中，M5C出现的频率也不尽相同。将限制性内切酶和甲基化酶同时作用，可使有几种可能识别顺序的限制性内切酶只对其中一种识别顺序有效。例如限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是：5’……CPyCGPuG……3’3’……GPuGCPyC……5’Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是5’……CCCGAG……3’。如果有一个DNA片段，有AvaⅠ的3个识别顺序，当用AvaⅠ处理后可得4个片段。可是，如果先用TaqⅠ甲基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA顺序中的有些碱基甲基化，然后再用AvaⅠ去切，结果只有1个识别顺序可被AvaⅠ作用，只产生2个DNA片段。二、甲基化酶的种类在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶1.Dam甲基化酶DNAAdeninemethylaseGATC腺嘌呤N6位置引入甲基PvuIIBamHIBclIBglIIXhoIIMboISau3AI识别位点中含GATC序列ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列有些限制酶对Dam甲基化敏感不能切割相应的序列如:BclI,ClaI,MboI,XbaI等这;甲基化敏感的限制性内切酶.不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等.MboⅠ和Sau3AⅠ识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA2.Dcm甲基化酶DNAcytsinemethylase识别CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基EcoRII/BstNICCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响BstNI可避免这一影响受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等不受影响酶有：KpnIGGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等3.EcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGCTTG(N)6CACGAN6位置但识别位点少(1/8kb)研究较少而dam（1/256bp）dcm(1/512bp)4.SssI甲基化酶来自原核生物SpiroplasmaCG序列中的C在C5位置上甲基化可在未甲基化或半甲基化链上起作用许多酶对此甲基化敏感AatIIClaIXhoISalI等不敏感的有BamHIEcoRISphIKpnISssI甲基化的DNA受E.coliMcrA,McrBC,Mrr系统的限制5.其它甲基化酶DNMT11988年克隆出的真核生物的甲基转移酶.具有催化作用的c端和调节功能的N端.三、依赖于甲基化的限制系统E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列依赖于甲基化的内切酶mcrA,mcrBC,mrr•都限制由CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA•Mrr也限制m6A•McrBC切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55～103bp，需GTP大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统三个都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修饰的位点McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点四、甲基化对限制性内切酶酶切的影响1.修饰酶切位点①HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAACM.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割②BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割③构建DNA文库时•用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因组DNA•用M.EcoRI甲基化酶处理，•然后加上合成的EcoRI接头•当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA**AGCT*AGCTDpnI3.用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG肠道细胞的Gm6ATCCm5/4CGGMspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATCSau3AI可切割，MobI不可切割其它4.对基因组作图的影响在哺乳动物DNACpG序列出现的频率大约只有预计的1/5含CpG序列的识别序列极其稀少大多数CpG都发生甲基化含CpG的所有识别序列的酶不能切割思考题：某DNA序列中存在酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现酶切不动，试分析可能原因？