用2100芯片生物分析系统优化线粒体DNA序列PCR扩

作者MarkJensenAgilentTechnologies,Inc.2850CentervilleRoadWilmington,DE19808-1610USA摘要聚合酶链反应（PCR）产物分析，比较目标扩增产物和引物二聚体、非特异性特征产物等其它产物，是PCR方法优化的基本内容。这一过程需要在较宽的片段和浓度范围内对扩增的DNA产物进行精确而重复的测定。2100芯片生物分析系统非常适合对PCR反应的所有产物和副产物进行快速定量分析，从而使PCR扩增的优化开发更容易。前言PCR的优化通常是一个很繁琐而费时的过程，特别是当扩增片段中包含高或低熔解温度序列的长延伸时。优化的目的就是最大限度地减少多重次级产物，如引物二聚体和非特异性产物，同时使目标扩增产物达到最大量。用凝胶电泳分析扩增产物还不能满足要求，因为对次级产物不能进行准确定量分析。缺乏定量信息将延缓或混淆优化过程，甚至可能造成在不能获得最大选择性和产量的条件下进行最终的PCR反应。用2100芯片生物分析系统优化线粒体DNA序列PCR扩增应用2100芯片生物分析系统是处理PCR过程优化问题的理想工具。不仅能对次级产物进行精确而重复的测定，而且对片段大小和目标产物相近的次级产物也能进行分离和定量[1]。对所有反应产物都进行定量，就使用户有机会准确地确定PCR反应的整体效率和特定反应参数之间的数学关系式。这些关系式将被用于优化反应条件的确定。线粒体DNA（mtDNA）是一个具有许多PCR扩增困难的典型目标片段。人类mtDNA是一个在细胞质中发现的含37个基因的环形基因组（16569bp）。线粒体基因组包括一个称为D环或控制区的1100bp的非编码区。在D环中，发现有两段高度变异性DNA序列。这些区域，高变区1（HV1）和高变区2（HV2），含有足够的序列变异可用于人类身份的检测[2,3]。当不能从样品中提取足够量的完整基因组DNA时，mtDNA就成了下一个分析目标，因为一个细胞的胞质中就可能含有1000个mtDNA拷贝。经常可以从很少量或严重降解的样品中提取到mtDNA，如骨头、牙齿或头发，然后再经过PCR扩增。用扩增产物进行DNA序列分析。基因组学2由于样品降解减少了平均DNA片段大小，所以扩增HV区所需要的PCR循环数就取决于样品的时间和条件。如果DNA降解很少，每个HV区就可以用一次PCR进行扩增。而严重降解的样品则需要用一系列100-200bp的PCR反应，对HV区进行扩增。由于这些样品需要很多扩增策略，所以，mtDNA序列的扩增可以作为一个很重要的实例，说明2100芯片生物分析系统如何可以被用于促进PCR扩增过程的优化。方法本研究中，探讨了pH、Mg离子浓度和Taq聚合酶的活性对四种线粒体DNA序列扩增效率的影响。为了确保不使样品基质的变化影响结果，在研究开始时对DNA进行了批量提取。提取的DNA经过稀释并分成若干份，作为研究所用的DNA样品。提取步骤如下所述。DNA制备1.取10根带完整根部的头发，加入0.2mL提取缓冲液，56°C保温3小时。2.涡旋混合，并于95°C加热8分钟。3.15000g离心混合物5分钟。4.取100µL，加入900µLPCR扩增用PBS。5.用5µL稀释后的提取样品进行PCR。除反应缓冲液外，还用扩增反应对三个水平的Taq聚合酶进行了评价：1、1.5、2单位/反应。引物的选择引物位点根据装备部队DNA鉴定实验室对严重降解残留物建议的位点[4]进行选择。在某些情况下，为了更符合所有引物的熔解温度TM，引发位点略有变动。引物位置在mtDNA基因组D环的HV区内。用两段引物覆盖HV1，另两段引物覆盖HV2。引物位点的位置示意图见图1。表1.缓冲液组成缓冲液1x组成缓冲液A1.5-mMMgCl2,pH8.5缓冲液B2.0-mMMgCl2,pH8.5缓冲液C2.5-mMMgCl2,pH8.5缓冲液D3.5-mMMgCl2,pH8.5缓冲液E1.5-mMMgCl2,pH9.0缓冲液F2.0-mMMgCl2,pH9.0缓冲液G2.5-mMMgCl2,pH9.0缓冲液H3.5-mMMgCl2,pH9.0缓冲液I1.5-mMMgCl2,pH9.5缓冲液J2.0-mMMgCl2,pH9.5提取缓冲液提取缓冲液的成分如下：用0.137MNaCl配置的6.0%Chelex100、0.0027MKCl、0.010MNa2HPO4、0.0018MKH2PO4，pH7.4。用InvitrogenPCR优化试剂盒进行PCR优化评价。试剂盒中含10种缓冲液，pH从8.5到9.5，Mg离子浓度从1.5到3.5mM。用四种mtDNA片段的扩增反应对这些反应缓冲液进行评价。缓冲液的组成见表1。1602416365733400HV1HV2F4/R4263basesF2/R2271basesF15989R16252F15R286F3/R3217basesF1/R1224basesF16191R16408F157R381图1.引物位点的选择：基本位置根据Anderson参考序列[5]分配3对四种扩增的每个目标产物和副产物的量进行了分析。以前的研究已经确定，引物的最佳浓度为0.4µM，退火温度为55°C，本报告将不再讨论。结果图2的电泳图显示了四种扩增反应的产物图谱。在图2A中，可以看到在预计的目标化合物片段区域有两个峰。已知这种想象为C-异质性，表明在一个mtDNA样品的Cs运行中，两个序列组中有一个碱基500[FU]030405060708090100110[s]F1/R10.4F1/R10.41523223233277600AB50010001500[FU]030405060708090100110[s]F2/R20.4F2/R20.415600C5001000[FU]030405060708090100110[s]F3/R30.4F3/R30.41522426727628730431771600DC500[FU]030405060708090100110[s]F4/R340.4F4/R40.415600图2.四种mtDNA扩增的2100芯片生物分析仪电泳图；(A)F1/R1-224bp，(B)F2/R2-271bps，(C)F3/R3-217bps和(D)F4/R4-263bps。长度发生了变异。图2B和2C都只有一个同质的扩增产物，适合进行序列分析。图2D中，可以看到更严重的C-异质性。从2A和2D扩增产物的序列分析中，没有得到任何有用的序列数据。由于C-异质性是一个样品混合序列总体的结果，所有这种情况不能通过对本文讨论的扩增条件的改进而得到改善。这个问题一般需要从Cs的扩增中选择另外的引发位点才能解决。4为了探讨[Mg]对扩增产物的影响，分别在8.5、8.7和9.0三个pH水平对1.5到3.5mM的Mg离子浓度进行了测试。PH8.7缓冲液通过将固定Mg浓度的pH8.5和pH9.0反应缓冲液等量混合进行制备。Mg浓度对四种mtDNA扩增产物产量的影响见图3。图中明显可见，Mg的影响与pH和序列都有关系。PH8.5时，四种mtDNA产物中有三种的产量随着Mg离子浓度的增加而持续增长。两种扩增反应，F3/R3和F4/R4副产物的水平在相同Mg浓度范围内呈快速增长（数据未列出）。当pH升至8.7时，只有F3/RS和F4/R4的扩增产物随Mg离子浓度的增加而增长。PH9.0时，四个扩增产物的量均在Mg2.5mM时明显最大。研究了单一Mg浓度下pH的影响，pH范围从8.5到9.0。图4显示了Mg2.0mM时这一pH范围对产物的影响。图3.Mg水平对产物量的影响图4.反应缓冲液pH水平对产物量的影响在2.0mgMg条件下，pH8.5和8.7所有四个扩增产物的量都最大。在pH9.0，可以看到一个扩增产物F4/R4的量明显减少。PH9.5时，所有四种扩增产物的量都完全降低。研究了在缓冲液C中Taq酶活性对扩增目标产物和副产物量的影响，缓冲液C含2.5mMMg，pH8.5。结果见图5。5图5.Taq酶活性对主、副产物量的影响结果可见，目标产物的量随着Taq酶活性的增加而增长。但请注意，三种扩增副产物的量增加的速度更快。计算目标产物：副产物的比率显示，只有当每个反应只用1单位的Taq酶时，该比率最高。结论在对一组扩增反应条件进行优化时，总是需要对各种反应参数进行平衡。因而需要对PCR反应的目标产品和副产物进行精确测定。在mtDNA基因组HV1和HV2的四种扩增中，在pH8.7，Mg离子浓度2.0mM，每次反应使用一单位Taq聚合酶的条件下，能得到最高质量的目标产物扩增。2100芯片生物分析系统通过对mtDNA扩增产物和PCR副产物的快速定量分析，加快了这一PCR优化过程。其动态线性范围很大，即使目标产物和副产物的浓度相差几十倍能够进行比较。通过对pH、Mg浓度和Taq活性等反应参数与目标产物及副产物相对产量之间关系的准确分析，确定了获得序列质量PCR目标扩增产物最高相对产量的反应条件。参考文献1.M.Jensen.“UseoftheAgilent2100BioanalyzerandDNA500Lab-on-a-ChipintheAnalysisofPCRAmplifiedMitochondrialDNA”,AgilentTechnolo-gies,publication5989-0985E,“ForensicsandMitochondrialDNA:Applications,DebatesandFoundations”(2003)Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.,4,119–141.3.J.Butler,“ForensicDNATyping”,AcademicPress,NewYork,2001.4.M.Gabriel,E.Huffine,J.Ryan,C.Los,N.YangM.HollandandT.Parsons,“ImprovedStrategiesformtDNASequenceAnalysisofHighlyDegradedForensicRemains”,GeneticIdentityConferencePro-ceedings,TenthInternationalSymposiumonHumanIdentification,Orlando,FL,1999.5.S.Anderson,A.T.Bankier,B.G.Barrell,M.H.L.DeBruijn,A.R.Coulson,J.Drouin,etal.Sequenceandorganizationofthehumanmitochondr-ialgenome.(1981)Nature,290,457–65.如需了解更多信息如需了解有关我们产品和服务的更多信息，请访问我们的网站。安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的有关损失不承担责任。本资料中所涉及的信息、说明和指标，如有变更，恕不另行通知。©安捷伦科技公司，2005中国印刷2005年5月23日5989-3107CHCN