用Agilent2100芯片生物分析系统测定鱼类的PCR

作者SteveGarrettandJohnDooleyMolecularBiologyGroup,Dept.ofChemistryandBiochemistryCampden&ChorleywooodFoodResearchAssociation,ChippingCampdenGloucestershire,GL556LDUK摘要本应用报告介绍了安捷伦2100芯片生物分析系统在聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析鉴定鱼类中的应用。先对所有脊椎鱼类中存在的464bp细胞色素b目标序列进行扩增，然后用限制酶水解。在DNA500LabChip®上对这些片段进行分离，由于准确测定了片段大小，所以能与权威性的种类图谱进行直接比较。与经典的凝胶电泳和DNA染色技术进行PCR-RFLP片段分析相比，使用芯片生物分析系统具有明显的优势。前言近年来提供给消费者的鱼产品差别越来越大。从优质的鱼肉到廉价的鱼尾。鱼产品要经过捕获、加工到分销至全球各地的过程，需要确定产品所用鱼类的真实用Agilent2100芯片生物分析系统测定鱼类的PCR-RFLP图谱应用性和种系。因此，需要一种可靠而简便的种类鉴定方法，以支持标签法的强制性规范（欧盟理事会规则第104/2000和EC委员会规则第2065/2001）。形态学鉴定法是适合整条鱼的种系鉴定方法，但是，一旦进行了加工，鱼种鉴定将变得很困难。蛋白图谱也可以用来进行鱼类鉴定，但这种方法需要和样品一起分析种类参考物质，由于加工过的食品中蛋白质已经变性，分析时可靠性较低。基于DNA的方法为鱼类鉴定提供了另一种途径，因为即使对于深度加工的样品，其DNA还是可以检测的。直接测序是最权威的鉴定方法，但是对于怀疑或已知其含有一个以上种类的样品，这种方法操作起来并不容易。因此，发展了其他的技术，用聚合酶链反应（PCR），以DNA指纹图谱为基础对鱼类进行鉴定。这些方法包括RAPD（随机扩增多态性DNA）、SSCP（单链构象多态性）和PCR-RFLP。曾有报导PCR-RFLP技术用于鲑鱼的鉴定[1,2]，包括用限制酶对扩增的细胞色素b464bp进行裂解，产生DNA图谱。食品安全2本研究的目的是用安捷伦2100芯片生物分析系统代替经典的凝胶电泳和染色步骤，对鲑鱼和其它鱼类的鉴定方法进行改进。在2100芯片生物分析系统上得到的种类特异性PCR-RFLP图谱，以及对各DNA片段按大小精确排列和定量，与凝胶电泳方法相比，具有简便、快速、鉴定精确等明显优势。材料与方法本研究所用的化学试剂除特别注明外均来自Sigma-Aldrich公司，分子生物学级或相当等级。PCR引物由MWG-BiotechUK公司提供。PCR-RFLP图谱用DNA500LabChip和安捷伦2100芯片生物分析仪获得。所有PCR反应中所用的AmpliTaq®GoldDNA聚合酶来自应用生物系统公司。限制酶来自新英格兰Biolabs，按厂商说明使用。鱼类样品具有重要商业价值的鲑鱼和牙鱼样品来自英国、加拿大、阿拉斯加、新西兰、日本的相应水产研究实验室。采用5个样品以减少种群中多态性变异的影响。每种鱼的其它样品来自英国当地鱼商和零售店。DNA提取用改良的CTAB方法进行DNA提取。将样品（2g湿重）悬浮于5mLCTAB缓冲液（2%CTAB，溴化十六碳烷基三甲铵，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH8.0）中，并加入40μL蛋白酶K溶液（20mg/mL）。样品彻底混合，然后60°C保温过夜。保温后，将1mL悬液转移至2.0mLEppendorf管中，冷却至室温（RT），并于13000g离心10分钟。取上清液，加入等体积的氯仿。溶液涡旋混合，并于16000g离心15分钟，然后将上面的水层转移到一个干净的1.5mLEppendorf管中。加入等体积的异丙醇，使DNA在室温下沉淀30分钟。16000g离心15分钟使DNA聚集，用70%乙醇清洗，并在室温下空气干燥30分钟。将DNA沉积物再悬浮在100μLSDW[Define]中，用Promega的Wizard®纯化树脂按厂家说明进行纯化。DNA提取物复溶于50μL1×TE缓冲液中（10mMTris-HCl，pH7.4，1-mMEDTA，pH8.0）。DNA的最终浓度（ng/μL）用GeneQuantproDNA计算器（Pharmacia）测定。DNA扩增在含1xAmpliTaqGoldPCR缓冲液（应用生物系统公司）的20μL反应溶液中对DNA提取物（50ng）进行扩增，没种引物300nM（L14735:5'-AAAAACCACCGTTGTTATTCAACTA-3’和H15149:5'-GCICCTCARAATGAYATTTGTCCTCA-3'）、200nMdNTP、5mMMgCl2和0.05U/μL的AmpliTaqGold酶（应用生物系统公司），得到PCR产物（来自细胞色素b基因的464bp）。扩增使用PE9600仪（应用生物系统），扩增程序为94°C5分钟（变性）；再按94°C40秒，50°C80秒，72°C80秒（扩增）循环40次；72°C7秒（最后延伸）。将未纯化的PCR产物（1μL）用2100芯片生物分析仪进行扩增确认。PCR-RFLP图谱未经纯化的PCR产物（2.5μL）用2到5种酶裂解3小时以上（总体积为5μL）。65°C保温10分钟终止反应。裂解后的PCR产物(5μL)在置于DNA500LabChip之前，与5μL20mMEDTA混合，最终浓度为10mMEDTA。按照厂商说明，用1μL反应混合物在2100芯片生物分析仪上进行分析。结果用2100芯片生物分析仪上得到的PCR-RFLP图谱进行鱼类鉴定用鲑鱼对PCR-RFLP方法进行了初步评价。扩增后的DNA片段用限制酶裂解后，在2100芯片生物分析仪上分离得到种类特异性PCR-RFLP图谱。PCR-RFLP图谱的实例见图1，这里显示的是鲑鱼和鳟鱼样品用DdeI和HaeIII酶裂解得到的PCR-RFLP图谱。315bp600bp23456789101112L1S1TS2S1S2TDdeIHaeIII图1.鲑鱼和鳟鱼样品用DdeI和HaeIII酶裂解得到的PCR-RFLP图谱。两个鲑鱼（S1、S2）和一个鳟鱼（T）样品的DNA扩增后，用DdeI（1–6道）或HaeIII（7–12道）酶解，得到PCR-RFLP谱。显示15–600bp的分子量标准排列（L）。每孔中都含有15bp和600bp的标志物。DNA片段已注明（箭头）表1可见五种酶和四种鲑科鱼类的实测与理论片段。由此可见，图谱与以前的报道基本一致[1,2]。大于25bp的理论DNA片段很容易检测，但是，一些更小的片段没有检测出来，因为他们无法与更小的15bp标志物分开，或超出了LabChip的检测范围(25bp–500bp)。某些裂解物中的小DNA片段(25bp–100bp)以前未见报道[2]。说明，这种方法与凝胶电泳法相比谱带的分辨率有所改善。用DdeI得到的图谱也显示了这种分辨率的提高，因为所有四种鱼类都有一个9bp的额外片段，比理论的大片段要小。这是由引物H15149产生的另外DdeI位点所至。表1显示用NlaIII得到的O.gorbuscha和O.mykiss图谱只有两个片段，而理论预测有三个。这是由于两个较大的片段发生了共迁移。对O.mykiss464bp扩增产物的序列分析表明，用NlaIII裂解扩增产物应产生192bp、180bp和91bp三个片段。这些片段分别相当于Russell等（2000）报导的210bp、190bp和100bp片段（见表1）。从序列数据中可见，没有证表1.用五种限制酶和四种鲑鱼得到的理论与实际PCR-RFLP片段每种酶的理论*（E）与实测（O）片段（bp）鱼类DdeI**Bsp1286IHaeIIINlaIIISau3AIO.nerka（红鲑鱼）E360,130300,200350,130310,180390,120O353,346,114289,172320,102,35或421272,160340,115O.gorbuscha（粉红鲑鱼）E360,130U/C***U/C210,190,100390,120O349,343,112464421181,92338,115S.salar（大西洋鲑鱼）E350,130300,200350,130U/C410,110O321,312,110287,172318,98,35438370,88O.mykiss（彩虹鳟鱼）E360,130300,200350,130210,190,100U/CO348,339,111279,174313,100,33185,92451*片段大小由Russell等报道（2000）**DdeI图谱中测得的另外片段是由引物H15149引入的限制位点所至***U/C用酶没有切开4据表明较小的180bp片段包含较高比例的A或G较重碱基，或较大的192bp片段包含较高比例的C或T较轻碱基，这些因素都可能使对应的分子量集中。计算出的两个片段间分子量差（3277道尔顿）与碱基数之差相当。由于两个片段的分子量相似，不容易发生共迁移。经常发生两个片段共迁移为一个片段的情况，对种类的鉴定不会造成影响。总之，用2100芯片生物分析仪得到的图谱与预测或以前的报导符合[1,2]，从而支持了这种方法可以用于鱼类鉴定的观点。用大西洋鲑鱼和鳟鱼，以及更少量的酶，对这方面的应用做了进一步验证。实验重复性为了测定整个方法的实验重复性（芯片实验室之间的变异性），用两个鲑鱼和一个鳟鱼样品重复进行PCR。扩增片段DdeI裂解，裂解产物用前保存在4°C。用四种条件进行PCR-RFLP图谱的分离，不同的DNA500LabChip，灌入两批不同的凝胶基质A和B。用新配制的凝胶基质（基质A）运行两个LabChip，凝胶基质A放置一周后运行第三个LabChip。第四个LabChip和第三个LabChip同一天运行，但使用的是第二批新配制的凝胶基质（基质B）。表2列出了总的变异性（包括不同芯片实验室、PCR和凝胶基质所产生的差异），在表2中显示了四个LabChip对DdeI酶裂解产物的分析结果。结果显示的是每种鱼类两次重复PCR在各LabChip上测得的平均片段大小。一个LabChip上绝对片段大小差异，即，同一个样品或两个鲑鱼样品之间重复PCR，小于2bp，而且只在较大片段（300bp）之间才能测出这种差异。每个片段的绝对大小差异，包括不同LabChip、PCR反应和凝胶基质产生的差异，稍大一些；鲑鱼320bp片段的差异最大，为6bp（321bp到327bp）。鱼类的鉴定用从10种不同牙鱼类得到的序列数据，从一定范围限制酶得到理论PCR-RFLP图谱。对这些理论图谱进一步检查表明，只有三种酶能用于区分所有牙鱼。得到实验图谱，证明用这三种酶可以进行鱼的种类鉴定。分析结果见图2，显示，只用一种酶能通过图谱鉴定10种鱼中的9种。另外两种要用其它两种酶进行区分。表2.在四种不同DNA500LabChip上分离用DdeI裂解的DNA所得PCR-RFLP片段在各LabChip测得的片段大小(bp)预测的LabChip1LabChip2LabChip3LabChip4条带大小(bp)(新配基质A)(新配基质A)(新配一周基质A)(新配基质B)平均%RSD鲑鱼分析*1171111111101111110.343123143163143173150.433203233253233263240.51鳟鱼分析1161111111101111110.453393383413383433400.723483473493473523490.61*2100芯片生物分析仪没有检出鲑鱼的预计27bp片段5Cod×DdelSample17×DdelSample18×DdelSample2×DdelSample14×DdelSample5×DdelSample8×DdelSample9×DdelSample19×DdelSample4×DdelCo