4.1植物遗传转化方法和技术

第四章植物基因工程天津大学杨少辉植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因植物。基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测本节主要内容根癌农杆菌介导法基因枪介导法其它转化方法第一节植物遗传转化方法常用的植物转基因方法：到目前为止,已确立了11种植物转基因方法。根据其转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系统，不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物生殖细胞等种质媒介的种质转化系统。现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受体细胞等归纳如图4-1。一、根癌农杆菌介导法根癌农杆菌介导法的分子机制农杆菌介导法需要具备的条件农杆菌介导法的基本流程1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症（1）冠瘿瘤的起因：由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。（2）冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌农杆菌介导法的分子机制2、Ti质粒根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。①为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；②参与寄主细胞合成激素的能力；③诱发植物产生冠瘿瘤；④赋予寄主分解冠瘿碱的能力；⑤决定寄主范围。（1）Ti质粒的功能（2）Ti质粒的功能区域–T-DNA区–Vir区–Con区–Ori区200kb①T-DNA区（transferred-DNAregions）：核心区左边界右边界T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。Vir区是一段长度为35KB操纵子；包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。②Vir区操纵子基因的结构与功能LBRBT-DNAVir③Con区（regionsencodingconjugations）该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。④Ori区（originofreplication）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。定向转移到寄主植物细胞内T-DNA链整合植物基因组受伤植物产生酚类物质，诱导Vir基因的表达编码核酸内切酶依次在RB、LB序列中产生缺口单链T-DNA被释放3、T-DNA转移的机制植物细胞酶体系合成双链T-DNA链分子VirE2蛋白的核定位作用4、植物遗传转化的载体系统一元载体（顺势载体）双元载体（反式载体）①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb；②分布各种限制酶的多个切点；③T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体：5、农杆菌介导的转化质粒的构建PG2TNOSAmprPG1T目的基因报告基因，选择标记基因目的基因报告基因，选择标记基因LBRB启动子的选择35S,cauliflowermosaicvirus35SpromoterCaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.（二）农杆菌介导法需要具备的条件高效的植物基因转化受体系统受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。具有有效的选择系统。稳定的转化技术和基因表达。1、高效的植物基因转化的受体系统•成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。•受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。A.植物基因转化受体系统的条件（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性（6）具有经济价值或理论研究意义。B.植物基因转化受体系统的类型1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体因此需要连续的再生系统2.直接分化再生系统外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。3.原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。4.胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。5.生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。2、选择系统选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在目的基因上连上一个选择标记基因。主要是编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有：新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)、新霉素抗性基因（neo）、庆大霉素抗性基因（gent）、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有效，对豆科和单子叶植物效果不佳。A、新霉素磷酸转移酶基因（Npt-II）B、庆大霉素抗性基因（gent）该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。C、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）D、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta），膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。（三）农杆菌介导法的基本流程大豆子叶节法为例：大豆子叶节器官发生系统的优化大豆农杆菌转化系统的优化1.大豆无菌苗的获得2.外植体的制备（类型、生理状态）3.高分化率基因型的选择4.丛生芽诱导培养基的确定5.丛生芽伸长培养基的确定6.生根培养基的确定7.移栽大豆子叶节器官发生系统的优化01234567科丰6科丰14冀豆12吉林35铁丰29无腥一号冀黄13品种variety每外植体芽数Shootsperexplant1.0mg/L1.2mg/L1.5mg/L1.7mg/L2.0mg/L1.选择压的确定2.农杆菌侵染液的制备3.外植体苗龄4.预培养（时间）5.农杆菌的侵染（浓度、时间）6.共培养（时间）7.选择培养8.抗性芽的伸长9.生根培养农杆菌转化系统的优化F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体棉花(a)Embryogeniccalligeneratedfromthescutellaofmatureseeds.ArrowheadsshowactivelygrowingcalliappropriateforAgrobacteriuminoculation.(b)InoculationofcalliwithA.tumefaciens.(c)Proliferationofhygromycin-resistantcallionN6D-Smedium3weeksaftertransfer.Leftcalliareresistanttohygromycinandrightcalliaresensitive.(d)ShootregenerationfromcalliresistanttohygromycinonMS-NKmedium3weeksaftertransfer.(e)Rootingandgrowthoftransgenicriceplants.二、基因枪法（微弹轰击法）1、工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。2、操作步骤：（1）制备DNA微弹；（2）准备靶外植体材料；（3）DNA微弹轰击；（4）培养轰击后的外植体．immatureembryoshighosmoticmediapreparecalli3、转化率影响因素：金属微粒：金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂：这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度微弹速度植物材料内在因素基因枪法的优点：无宿主限制；靶受体类型广泛；可控度高；操作简便。问题：1.转化效率低；2.嵌合体多；3.稳定性差，瞬时表达；4.外源基因沉默；5.整合机理不详。4、基因枪转化法的特点：花粉管通道法在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。花粉粒的内壁通过花粉外壁上的萌发孔（或沟）向外伸出的细管。一般每个花粉粒萌发时产生一个花粉管，具多萌发孔的花粉粒开始可以同时长出数个花粉管，但最终只有一个继续生长。花粉管是靠其末端生长的，在高倍显微镜下可见花粉管末端有一个透明的半球形区域称帽区。帽区之后的细胞质中含有多种细胞器，这与花粉管的生长有关。花粉管长到一定长度后，原来花粉粒中的内含物全部集中到花粉管的前端，花粉管从柱头经花柱到子房，再进入胚珠及胚囊，将花粉管中的两个精子及全部内含物释放到胚囊中，以便受精作用的进行。花粉管是雄配子体的一部分。将目的基因导入植物细胞－花粉管通道法三、PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。案例：转基因烟草步骤：1.共保温；2.稀释PEG；3.非选择培养；4.选择培养。