细胞培养

细胞培养基本操作一，清洗和消毒胶塞的清洗新老胶塞的清洗1.2%NaOH煮沸10-20分钟2.用水冲洗后，用1%HCl浸泡30分钟。3.自来水冲洗，蒸馏水洗2-3次4.一般冲洗：用洗衣粉清洗，自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍。塑料器皿的清洗1.2%NaOH浸泡2.用1%HCl浸泡30分钟3.自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍玻璃器皿的清洗1.用试管刷和洗衣粉刷干净瓶子，用自来水冲10遍，确保将洗衣粉冲干净。2.凉干后浸泡进酸缸，时间不得少于6小时。3.捞酸后，用自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍，烤干。手术器械的清洗1.实验完成后，洗衣粉将其清洗一遍，凉干。2.使用之前高温消毒或用75%的酒精浸泡。高压锅的使用培养基DMEM，胰酶的配制DMEM的配制：胰酶的配制：抗生素的配制：1.青霉素（80万单位/瓶）+无菌双蒸馏水2ml2.链霉素（100万单位/瓶+无菌双蒸馏水2ml将上述2ml的青霉素和2ml的链霉素混合在加入36ml的双蒸馏水配制成储备液。混匀，分装，-20OC保存。使用时，配制成0.5ml青-链霉素储备液/100ml培养基3.庆大霉素8万单位/支×2支2ml/支×=4ml，加入无菌的双蒸馏水36ml配制成储备液。-20OC保存，使用时，100ml培养基加1滴，终浓度为0.5-1ml/100ml培养基。二，细胞培养细胞株的传代培养法1.吸去原来培养瓶中的培养基2.PBS轻轻冲洗一遍，吸去。3.用0.025%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化细胞，见细胞收缩后，吸去胰蛋白酶，加入新的培养基终止消化4.用吸管小心地吸取培养基反复吹打，分装在每一个培养瓶中。内皮细胞原代培养方法：1.在动物的颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉；2.清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用PPS冲洗两次，沿正中剪开，内膜朝下切于已经滴加少量0.1%胰酶和0.02%EDTA的培养皿中，20消化10min。用细胞挂子轻轻刮取内膜上的内皮细胞，置入加有RPMI-1460培养液（含20%小牛血清，2×105U/L青霉素和200mg/L链霉素）的培养瓶中。3.置于培养箱内培养，约4-5天保长满整瓶，即进行传代。细胞解冻方法1、先准备37-39度温水；2、从液氮罐中取出细胞，迅速放进水中，振摇至复温。3、用吸管吸进培养瓶中，加进培养基，6小时后可换液，24小时可传代。细胞冻存方法1、选对数生长期的细胞，在收集细胞的24小时前换液一次；2、吸除旧的培养液，消化，再加入旧的培养液终止消化；3、合并细胞于一只试管中，用塞子塞好，离心2分钟，去掉上清液；4、在细胞中加入90%血清（约18滴）和10%DMSO（约2滴），或用50%的血清，40%的培养基，10%的DMSO；5、放入冻存管中，与40C（10分钟）——-200C（2小时）——-400C（2小时）；6、最后放入液氮罐中，登记。细胞转染步骤1、转染前24小时细胞快速传代，将细胞传至24孔板中，细胞数为1~3╳105/孔，24小时后长至90%以上；2、取0.8~1.0μgDNA到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl；3、取1~3μLF到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl（混合5分钟，不要延长时间）；4、1和2混合，室温放置20分钟；5、放置的最后的3分钟，吸去24孔板的培养基，用PB洗一遍，加入500μl不含血清和抗生素的F12/DMEM；6、将4加入到转染的24孔板中；7、370C5%CO2温育6小时，弃去原培养基，加入新鲜的培养基；8、恢复24—48小时后加抗生素进行筛选。注（2、3、4要用进口）Fura-2操作步骤一、细胞部分1、用胰酶消化细胞，加入2ml原液终止消化；2、负载：加10%BSA20μl和2μlFura–23、孵育25分钟，每隔8分钟吹一次；4、50离心1分钟，控干液体，加入2ml测定液HBSS；二、上机操作部分1、POWER，开Xelamp；2、待屏幕出现READY，CHANGE+[10]↙+[1]↙+[1]↙3、START/STOP（先后各一次即可）；4、待屏幕出现READY，再一次CHANGE+[10]↙+[1]↙+[2]↙5、出现READY后，按PAGE调Y轴基线至-3.39，调至8，调至1286、按STRAT三、存盘操作1、DATAPROC+[2]；2、将当前屏幕中文文件存入23号文件，输入23↙3、DISKOPER+[1]↙+[1]↙4、[1]=21↙[2]=（磁盘自编文件号）↙5、重复3，操作[1]=22↙[2]=（磁盘自编文件号）↙6、重复3，操作[1]=23或24↙[2]=（磁盘自编文件号）↙7、DATAPROC+[4]↙+23↙四、调出文件操作1、DISKOPER+[1]↙+[2]↙2、[1]=（原22号文件）↙，[2]=（存入内存的空文件）；3、DISKOPER+[1]↙+[2]↙4、[1]=（原23号文件）↙，[2]=（存入内存的另一个空文件）；基因转染技术基因转染的概念将目的基因导入体细胞，使其在细胞中得到表达，并产生相应功能的技术。基因转染的种类磷酸钙法电击法脂质体法显微注射法逆转录病毒介导法其他稳定表达转染瞬时表达转染基因转染的步骤1.目的基因（DNA）的准备包括环状的质粒DNA或片段DNA的制备要求：纯度高，1.8OD2802.02.目的基因导入细胞（脂质体转染法为例）例A：DOTAP脂质体转染法1，取将要转染的DNA2.5μg，用无血清、无抗生素的DMEM/E12培养基稀释成50UL。2，取70ULF12于聚苯乙烯管（即冻存管），加进30UL的DOTAP小心吹吸混合，室温静置1-2min。3，将1加入，与2小心吹吸混合，室温静置15min。4，弃去原细胞培养液，小心加入5mlF12培养基（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素），将3均匀加入，轻轻晃匀。5，继续培养6小时，吸去旧培养液，加入新培养液（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）。6，恢复生长2天后，加入G418进行筛选培养，保持每2-4天换一次培养液。7，约1-2周后可以见到具有G418抗性的细胞克隆。继续培养，当细胞克隆生长到1/4-1/2低倍视野时，挑取数个克隆，转入其他培养瓶继续作G814维持培养。例B：Superfect脂质体转染法1，取2μgDNA，用无血清、无抗生素DMEM-F12稀释到100μl。2，取10μlsuperfect到上述混合液中，轻轻吹吸5-6次，混匀。3，室温放置5-10min。4，放置的最后3min，吸去原有的培养基，用PBS洗一遍。5，加入600μlDMEM-F12（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）到上述转染混合液中，轻轻吹吸3-4次，混匀。6，将上述混合液加入到3.5cm直径的平皿中。7，37℃5%CO2温育2-3小时，弃去原培养基，用PBS洗3-4次，加入新鲜的培养基（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）。8，恢复生长2天后，加入G418进行筛选培养：保持2-4天换一次培养液。9，约1-2周后可以见到具有G418抗性的细胞克隆。继续培养，当细胞克隆生长到1/4-1/2低倍视野时，挑去数个细胞克隆，转入其他培养瓶继续作G418维持培养。！！！注意1，高纯度目的基因的制备，质粒可用QIAGEN公司的去内毒素质粒大量提取Kit，片段可用QIAGEN公司的片段DNA回收Kit或让上海生工公司合成。2，转染前细胞要快速连续传代（两次以上），末次传代后20-24小时进行转染，此时细胞融合度应为30-50%（生长迅速的细胞）或70-80%（生长缓慢的细胞）。3，盛放和吸取脂质体的塑料用品都要用进口的聚苯乙烯材料。防止转染时器皿吸附脂质体。4，用完脂质体后，要将瓶口封紧，否则会氧化失效。5，脂质体和DNA混合时，绝对不能有蛋白质存在。6，血清最好选用进口的胎牛血清，如Hyclone和GibcoBRL公司。也可选用杭州四季清公司的胎牛血清或新生牛血清。7，G418筛选期间，应注意换掖，保持每2-4天换一次培养液。8，G418筛选和维持的剂量应在转染前做预实验确定。一般来说，维持剂量应为10-14天内正好能杀死全部细胞的剂量，而筛选剂量则应是该剂量的1倍左右。9，细胞克隆的挑取，可用有限稀释法或克隆环法。10，瞬时表达转染，在转染恢复生长24-72小时后，不做筛选，之间进行检测实验。免疫印迹原理将蛋白质抗原样品变性，SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳后，转印到膜上，利用抗原与抗体结合的特异性，与相应的一抗孵育，用二抗放大一抗检测到的信号，并显示检测信号，从而判断膜上有无待测的蛋白质抗原的存在及量的多少。同时应用蛋白质分子量Marker，还可以判断待测定蛋白质抗原的分子量。试剂和材料1.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳试剂（略）2.2×上样缓冲液（100mmol/LTris-Cl;200mmol/LDTT;4%SDS;0.2%溴酚蓝；20%甘油），β-巯基乙醇。3.电转缓冲液（Tris3.03g;甘氨酸14.4g，200ml甲醇/1000ml）4.PBS（130.0mmol/LNaCl，2.5mmol/LKCl，10.0mmol/LNa2HPO4，1.5mmol/LKH2PO4，pH7.4）5.1%和5%的脱脂奶粉（PBS）溶液（w/v）6.PBST（含5%oTween20的PBS，v/v）7.生物素标记的蛋白质分子量Marker，一抗，二抗，化学发光试剂kit8.硝酸纤维素膜，Whatman3M滤纸仪器电泳仪、小型垂直电泳槽和转移槽（BIO-RAD公司，USA）操作步骤1.配制电泳分离胶和浓缩胶（SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳）。2.取一定量的蛋白质样品，与等体积的2×上样缓冲液混合，另取3μl生物素标记的蛋白质分子量Marker与等体积的2×上样缓冲液混合。3.各管混合液加入5%-10%的β-巯基乙醇，煮沸变性5min。4.上样。5.电泳：浓缩胶中/电压120V，电泳15min，分离胶/电压200V电泳30-40min。6.卸下分离胶，用电转BUFFER，平衡洗3次每次10min7.将PVDF膜配制胶分离胶与积层配方：成分：10%分离胶（10ml）8%分离胶（10ml）5%积层胶（5ml）去离子水（ml）44.63.430%丙烯酰胺溶液3.32.70.831.5mol/LTris(ph8.8)2.52.51.0mol/LTris(ph6.8)0.6310%SDS0.10.10.0510%过硫酸铵0.10.10.05TEMED0.0040.0060.005注意：先配分离胶，加至齿线下1cm，上层加DW封闭，画线标记，放置30min(气温低可置37℃30min)；再配积层胶。待分离胶凝固后，倒弃上层水，加积层胶，放梳子，固定20min(气温低可置37℃20min)，取出梳子，用DW洗涤未聚合的胶，用滤纸吸干（要使齿尽量放下，然后相互狸漏出，灌胶时应将分离胶灌上一些，以免梳子与分离胶相隔太远）。加样计算蛋白浓度eg:pro量/pro浓度=体积（取最小值定蛋白量：0.74×18.8=蛋白量）样本号123空白各样本蛋白浓度（ng/ul）0.920.860.740所需各样本体积（ul）171818.80需补悬浮buffer储存液或去离子水体积（ul）1.80.8018.82-巯基乙醇（2—MEul）1.21.21.21.22×上样Buffer（ul）5555↓振荡，离心（使集中与小EP管底部，事先用钟头给小EP管打孔）↓置泡沫板上100℃水浴10min↓放冰上备用↓点样（每个样本体积相当于25ul,空间不能有间隔，量可调整）电泳（在冰箱内进行）跑积层胶：80v30min↓跑分离胶：120v60min或60v12h（过夜）使溴酚蓝到胶底，caveolin-1可以不↓转膜（注意正反，pro带负电，放在负极，膜正极）↓100Ma从黑加到白，黑为“-”极，红为“+”极取出胶，切去积层胶，在1样本处切一小口↓转到放有海棉和三层滤纸上，用转移buffer浸泡10min，有颜色的朝外，滤纸要比胶大↓（胶用DW洗）将剪好的PVDF膜用甲醇泡10min，，用DW洗三次，