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生物芯片技术(BIOCHIPTECHNOLOGY)研究历史(Researchhistory)•1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNAChip概念•Stanford大学Brown实验室：预先合成，机械手阵列•1995Schena等：基因表达谱•1996Cheeetal：DNA测序•1996Croninetal：突变检测•1996Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆•1996Shalonetal：复杂DNA样本分析•1996Shoemakeretal：缺省突变定量表型分析第十章生物芯片技术•生物芯片（biochip）的概念–指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。•根据生物分子之间特异性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特性性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等•生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。•未来十年最具发展潜力的技术。第十章生物芯片技术•生物芯片的主要特点：–高通量、微型化和自动化•常用的生物芯片的分类：基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室特点•高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。•多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。•微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。•自动化：降低成本，保证质量。第十章生物芯片技术1.基因芯片（Genechip）又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。第十章生物芯片技术2.蛋白质芯片(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。第十章生物芯片技术3.芯片实验室(labs-on-chip)•高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。•实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。•芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。其他分类方法（根据应用）•基因变异检测芯片–疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)–法医鉴定(如DNA指纹图谱)•表达谱芯片–肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异)–药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异)–发育(同一组织不同发育时期基因表达差异)–组织发生(不同组织或器官的基因表达差异)根据工艺和载体1.原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。2.DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。根据DNA成分•寡聚核苷酸或DNA片段：约2025个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）。•全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。基因芯片的种类•ScienceChip：生物分析和诊断•NutriChip：食物分析、转基因、污染检测•LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析•AquaChip：水质分析•SecureChip：含DNA的物质鉴定•ChromoChip：基因分析和染色体序列•ProkaryoChip：原核生物、兽医、环保等第十章生物芯片技术第二节蛋白质芯片第一节DNA芯片第一节DNA芯片第一节DNA芯片DNA芯片技术包括四个主要步骤•芯片的设计与制备•样品制备•杂交反应和信号检测•结果分析生物芯片技术主要环节•芯片制备：微点阵•样本制备：DNA提纯、扩增、标记•杂交：样本与互补模板形成双链•检测：共聚焦扫描，双色激光•数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。•结果第一节DNA芯片第一节DNA芯片二、样品的制备三、杂交与结果分析四、基因芯片技术在医学中的应用一、芯片制备一、芯片制备基因芯片制备主要包括两个方面•探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针。•探针在芯片上的布局：选择合适的方式将探针排布在芯片上。一、芯片制备（二）DNA芯片的制备（一）探针的设计（一）探针的设计1.表达型芯片探针的设计不需要知道待测样品中靶基因的精确细节序列的特异性应放在首要位置2.单核苷酸多态性检测芯片探针的设计等长移位设计法3.特定突变位点探针的设计叠瓦式策略一、芯片制备一、芯片制备图10－2（二）DNA芯片的制备1．载体选择与预处理•载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应的固相材料。•载体材料：玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚丙烯膜等。•载体的化学处理：活化剂——多聚赖氨酸氨基硅烷偶联剂一、芯片制备2．基因芯片制备（1）原位合成（insitusynthesis）①光导原位合成法②原位喷印合成③分子印章多次压印合成（2）点样法芯片制备•原位合成法（insitusynthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。一、芯片制备•图10－3•合成后交联（post-syntheticattachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。两种制备方法比较•原位合成：测序、查明点突变高密度、根据已知的DNA编制程序制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列•合成后交联：比较分析制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化，交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存大量样品。二、样品的制备•样品的制备过程包括核酸分子的纯化、扩增和标记样本制备•制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。•用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。•样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。三、杂交与结果分析（一）杂交反应：与传统的杂交方法类似（二）杂交信号的检测：最常用荧光法（三）数据分析：芯片杂交图谱的处理与存储由专门设计的软件来完成。杂交•是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步–液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。–选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。–合适长度的DNA有利于与探针杂交。–温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。–最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。结果分析芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：•共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。•质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。•化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。芯片扫读装置•根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。•根据激光光源，可分为激光型和非激光。•应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。图象分析•复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。•分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。•图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。四、基因芯片技术在医学中的应用1.基因表达分析2.基因型、基因突变和多态性分析3.疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤4.药物筛选5.指导用药及治疗方案6.预防医学四、基因芯片技术在医学中的应用生物芯片分析原则•1、测定过程应包括五个基本步骤：–需解决的生物学问题–样本制备–生物化学反应–检测–数据分析2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。4、所有基因分析必须平行处理。5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。7、检测系统必须能精确地获得数据。8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。9、两种或以上平行数据组比较应受到单个实验所固有特性的限制。10、绝对比例关系只存在于组合实验的平行数据组内。11、平行格式包括内在和外部的整个系统误差的分析因素。12、在每个系统模块中采集到该系统所有变量的四维数据时，才能称为完成生物系统平行基因分析。生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见~schena/质量控制•实验对照：体外转录从cDNA合成mRNA，参入标本中作为对照。此mRNA不与点阵的核酸杂交。将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本间标准化的参照。用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，如果两种荧光强度一致，可排除标本间变异因素。用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。结果有效性的证实•在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。•比较两种不同DNA序列表达水平时，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交。•证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(区别基因族成员,比较不同DNA种系表达,证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平)、NorthernBlot(证实某一基因的相对表达水平)、WesternBlot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。第二节蛋白质芯片第二节蛋白质芯片•蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。第二节蛋白质芯片根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为两种1.蛋白质功能芯片细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性。2.蛋白质检测芯片将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中靶多肽的高度特异性配体进行点阵。这种芯片能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质。第二节蛋白质芯片第二节蛋白质芯片蛋白质芯片技术在医学中的应用1.特异性抗原抗体的检测2.生化反应的检测3.疾病诊断4.对疾病分子机制的研究5.药物筛选及新药的研制开发抗体和蛋白质阵列技术•蛋白质组学(protiomics)的兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。–PareickBrown使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质。–Leuking等采用蛋白质微阵列技术，测定了10pg的微量蛋白质，并证实假阳性极低。乳腺癌基因芯片Stanford乳腺癌微矩阵(Perouetal.1999)•每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。•颜色强度表示对照和实验cDNA的比率。比率相同时为1。•结果为红色表示mRNA增加，绿色表示减少